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J Korean Med Rehabi 2021 Jan; 31(1): 59-79  https://doi.org/10.18325/jkmr.2021.31.1.59
Genotoxicity Study of ChondroT
Published online January 31, 2021
Copyright © 2021 The Society of Korean Medicine Rehabilitation.

Sun-Gil Kim, K.M.D.*, Joo Il Kim, K.M.D.*, Ji-Hoon Kim, K.M.D.*, Chan Suk Yoon, K.M.D.*, Ji-Won Jeong, K.M.D.*, Chang-Su Na, K.M.D., Seon-Jong Kim, K.M.D.*

Departments of Korean Medicine Rehabilitation*, Meridian and Acupoint, College of Korean Medicine, Dongshin University
Correspondence to: Seon-Jong Kim, Department of Korean Medicine Rehabilitation, Mokpo Oriental Hospital of Dongshin University, 313 Baengnyeon-daero, Mokpo 58665, Korea
TEL (061) 280-7905
FAX (061) 280-7788
E-mail mofoster@hanmail.net
Received: September 15, 2020; Accepted: September 21, 2020
Abstract
Objectives This study was performed to observe the genotoxic effect of the ChondroT.
Methods To evaluate the genotoxicity of ChondroT, an experiment of bacterial reverse mutation test, in vitro mammalian chromosomal aberration test and mammalian erythrocyte micronucleus test in mouse was conducted.
Results TA98, TA100 and TA1537 strains in the absence of metabolic activation system (S9 mix), the number of revertant colonies being greater than 2-fold of the respective negative control value. Both in -S9 mix and +S9 mix, the frequencies of aberration cells with structural aberration and numerical aberrations of chromosome were less than 5%. There was no increase of polychromatic erythrocyte with one or more micronuclei at any dose of test substance compared to the negative control group (p<0.05).
Conclusions In TA98, TA100 and TA1537 strains in the absence of metabolic activation system (S9 mix), the number of revertant colonies was greater than 2-fold of the respective negative control value, showing positive results. ChondroT was considered to be non-clastogenic to Chinese hamster lung (CHL/IU) cells under the present experimental condition. and ChondroT was determined not to induce an increased frequency of micronuclei in the bone marrow cells of male ICR mice under the present experimental condition.
Keywords : ChondroT, Mutagenicity tests, Chromosome aberrations, Micronucleus tests
서론»»»

유전독성시험은 시험물질이 유전자 또는 염색체에 미치는 상해작용을 평가하는 시험을 말하며, 신약개발 과정에서 독성에 따른 후보물질 선별작업에 필수적으로 수행하는 시험 항목으로서 잠재적인 발암성 또는 돌연변이 유발물질을 검출하기 위한 시험이다1-3). 임상에 사용 중인 한약제제라 하더라도 다른 처방과의 조합이나 가감을 통해 그 독성이 증감하는 사례가 보고되고 있기에4), 복합처방으로 사용되는 한약제제에 대한 독성 시험 및 안전성 연구의 필요성이 증대하고 있다5). 의약품 개발에 있어 유전독성시험은 특정 화학물질 노출이 염색체 혹은 유전자 수준에 손상을 가해 형태적 변화나 기능 이상을 초래하는지 평가하는 것으로, 세균성 복귀돌연변이 시험과 소핵시험에 의한 시험관 내 유전독성 평가를 우선 시행하도록 권장한다6). 시험관 내 유전독성 시험 결과가 긍정적인 경우 그 결과가 생체 내에서 동일하게 적용하는지 평가하기 위해 생체 내 시험(in vivo)인 포유류 적혈구 소핵시험, 형질전환 쥐 시험법 및 혜성시험 등이 수행된다7).

ChondroT는 청강의감에 수록된 강활제통음8) 처방에서 강활, 당귀, 금은화, 위령선, 황백을 bio-informatics 기법9)을 활용하여 선별한 뒤 해당 약재를 6:4:4:4:3 비율로 혼합하여 만든 물 추출물이다. 선행된 연구에서 ChondroT는 강활제통음에 비해 관절염 치료 효과가 우수하였고10), adjuvant로 유도된 염증성 관절염 동물모델에서 관절염에 대한 유효성이 검증되었으며11) collagenase로 유발된 골관절염 모델에서 염증성 사이토카인 생성을 억제하고 이질통에 대한 회피반응을 감소시키는 것이 확인되었다12,13). 또한 monosodium-lodoacetate (MIA)로 발생한 관절염 동물 시험에서 염증성 사이토카인(interleukin [IL]-6, IL-β, tumor necrosis factor-α)의 생성을 억제하였고, 하지부종(paw edema)을 감소시켰으며, 조직학적 검사에서 연골을 보호하는 효과가 있었다14). Collagen과 thrombin으로 활성화된 혈소판에 대한 항응고 효과가 보고되었고15), 신장의 mouse urate transporter 1 활성도와 xanthine oxidase 활성도를 조절하여 혈중 요산 수치 감소를 통해 통풍을 억제하였으며16), 파골세포의 형성에 관여하는 nuclear factor-kappa B와 microtubule-associated protein kinases의 생성을 억제하여 골다공증을 예방하는 효과도 보고되었다17).

ChondroT에 대한 독성평가는 단회 경구투여 독성시험을 통해 최고용량이 2,000 mg/kg을 상회하는 것이 보고되었고18), 4주 반복 경구투여 용량결정시험을 통해 최고용량이 2,000 mg/kg 이상임이 확인되었으며18), 13주 반복 독성연구 결과 2,000 mg/kg/day의 무독성량(no-observed adverse effect level)을 확인하였다19).

이에 이전 13주 반복 독성연구에 이어 ChondroT의 유전독성 안전성 확보를 위해 Good Laboratory Practice (GLP) 인증기관인 한국화학시험연구원에서 진행한 박테리아를 이용하는 복귀 돌연변이 시험, 포유류 배양세포를 이용하는 염색체 이상 시험, 포유류 골수세포를 이용하는 소핵시험을 통해 유전독성 연구를 진행하여 유의한 지견을 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 약재

본 실험에 사용한 ChondroT는 ㈜정우신약(서울, 한국)에서 공급받아 사용하였으며, 처방구성은 Table I과 같다. ChondroT는 금은화 중 chlorogenic acid로서 1.7 mg 이상, 당귀 중 총 decursin 및 decursinol angelate의 총 합 0.85 mg 이상, 황백 중 berberine chloride로서 1.15 mg 이상의 지표성분을 함유하는 갈색의 건조엑스(3.4→1)로 시험물질 품질 평가를 통해 Lot number 901 ((주)정우제약, 아산, 한국)를 실험에 사용하였다.

Table I. Composition of ChondroT and the Used Parts of 5 Individual Herbs.

Scientific name Latin name Family Used part Source Rate
Ostericum koreanum Maximowicz Osterici Radix Umbelliferae Root Korea 6
Angelica gigas Nakai Angelicae Gigantis Radix Umbelliferae Root Korea 4
Lonicera japonica Thunberg Lonicerae Folium Caprifoliaceae Root China 4
Clematis manshurica Ruprecht Clematidis Radix Ranunculaceae Leaf China 4
Phellodendrom amurense Ruprecht Phellodendri Cortex Rutaceae Tree bark China 3


2. 실험방법

1) 박테리아를 이용한 복귀 돌연변이 실험

(1) 음성 대조 물질

시험물질을 200 mg/mL 멸균증류수에 10분 동안 vortex 용해하였고, 혼합했을 때에 발열, 발포, 변색이 없음을 확인하였다. 멸균증류수는 대한약품공업(주)(서울, 한국)의 제품을 사용하였고 상온(1~30℃)에서 보관하였다.

(2) 양성 대조 물질

식품의약품안전처 고시 2017년-제71호에서 추천되는 furylfuramide, sodium azide, 2-aminoanthracene, 9-aminoacridine, benzopyrene을 사용하였다. Furylfuramide는 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan) 제품을 사용했으며 상온(1~30℃)에서 보관하였다. Sodium azide, 2-aminoanthracene, 9-aminoacridine, benzopyrene는 모두 Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA) 제품을 사용하였으며 모두 상온(1~30℃)에서 보관하였다.

(3) 실험 균주

Salmonella typhimurium에는 TA100, TA1535, TA98, TA1537를 Escherichia coli에는 WP2uvrA를 Molecular Toxicology, Inc. (Boone, NC, USA)에서 공급받아 사용하였다. Nutrient broth 배지 중에서 10시간, 37℃ 전배양을 실시한 0.8 mL 균 현탁액에 0.07 mL의 비율로 dimethylsulfoxide (DMSO; Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 혼합 조성하였다. 분주량을 0.5 mL로 동결하여 -65℃ 이하에서 보관하였다.

(4) 배지

① Nutrient broth 조제

증류수 100 mL에 2.5 g의 비율로 Oxoid Nutrient Broth No. 2 (Oxoid Ltd., Hampshire, UK)를 더해 용해한 뒤 121℃에서 15분간 고압증기멸균하여 냉장 보관하였다.

② Top agar 조제

연한천에 다음의 수용액을 각각 사용 직전에 10%로 첨가하였다.

연한천은 증류수 100 mL에 0.6 g의 비율로 Bacto-agar (Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA) 및 0.5 g의 NaCl (Sigma-Aldrich Co.)을 합하고, 이것을 15분간 121℃에서 고압증기멸균하여 (55±5)℃에 조제했다.

살모넬라균은 0.5 mmol/L D-biotin⋅L-histidine 혼합 수용액을 사용 직전에 10% 농도로 연한천에 첨가하였다. 대장균은 0.5 mmol/L L-tryptophan 수용액을 사용 직전에 10% 농도로 연한천에 첨가하였다.

Top agar는 사용 직전에 조제되었으며, (55±5)℃으로 보온하였다. 2019년 5월 27일과 2019년 6월 10일에 자체 조제하였다.

(5) S9 mix (대사활성계)

S9은 수컷 Sprague Dawley (SD) rat에 500 mg/kg 농도의 Aroclor1254를 단회 복강 투여하여 효소를 유도한 후 5일째에 간으로부터 조제되었다. 동결건조된 S9 1 vial에 멸균증류수 2.1 mL을 첨가하여 현탁하였다.

Cofactor mix는 제조원 Oriental Yeast Co., Ltd. (Tokyo Japan)의 Cofactor-I에 멸균증류수 9.5 mL를 넣어 용해한 후 pore size 0.45 μm의 membrane filter로 여과한 것으로, 사용 시 조제하였다.

S9 mix는 Cofactor mix 9.5 mL당 S9 0.5 mL의 비율을 추가하여 사용 시 조제하였으며 냉장 상태를 유지하였다.

(6) 농도 결정 실험

가이드라인에 따라 시험균주 TA98, TA100, TA1535, TA1537, WP2uvrA를 최고 농도 5,000 µg/plate, 공비 √10으로 50, 150, 500, 1,500, 5,000 (μg/plate)로 구별하여 농도를 설정하였다.

농도결정시험 결과, 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA100 및 TA1537 균주에서 콜로니의 증가양상이 확인되었으며, 이 결과는 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA100 및 TA1537 균주에서 콜로니 수의 농도상관성(농도의존적 증가양상)을 판단하기 힘든 농도이기 때문에 재현성 및 농도상관성을 확인하기 위하여 최고농도를 10,000 μg/plate로 설정하고 공차 2,000 μg/plate 및 공비 2를 적용하여 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000 (μg/plate)로 구별하여 농도를 재설정하였다.

(7) 실험 방법

실험은 pre-incubation method를 이용하였으며, 대사활성계 미적용(-S9 mix)과 대사활성계 적용(+S9 mix) 환경에서 실시하였다.

  • ① 각 농도에 대해 멸균한 시험관에 음성대조물질, 시험물질 용액 및 양성대조물질 용액을 0.1 mL 첨가하였다.

  • ② 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 경우, 0.1 mol/L sodium-phosphate buffer (pH 7.4)를 0.5 mL 넣어 혼합한 뒤 0.1 mL 균 현탁액을 추가하였다.

  • ③ 대사활성계 적용(+S9 mix)의 경우, 0.5 mL의 S9 mix를 넣어 혼합한 뒤 0.1 mL 균 현탁액을 추가하였다.

  • ④ 이 혼합액을 20분간 37℃에서 진탕(진탕 횟수: 120회/분)하여 배양하였다(pre-incubation).

  • ⑤ Pre-incubation 후 이 혼합액에 2 mL의 top agar를 넣어 minimal glucose agar plate 위에 중층하였다.

  • ⑥ 중층한 top agar가 응고된 후 (48±2)시간 37℃에서 배양하였다.

(8) 판단 기준

콜로니 계수는 육안으로 이뤄졌으며, 최소 1개 균주에서 평판 당 복귀돌연변이 콜로니 수가 1개 이상의 농도에서 재현성 있는 증가를 나타낼 때 양성으로 판단했으며, 콜로니 수의 음성대조군 대비 증가 여부 및 농도상관성을 고려하였다.

(9) 결과의 집계

균의 생육저해는 (48±2)시간 배양 후 현미경으로 관찰하였으며, 침전 및 석출은 (48±2)시간 배양 후 육안으로 관찰하였다. 양성대조, 음성대조 및 시험물질의 각 처리에 대해 계수한 콜로니 수의 평균값 및 표준편차를 산출하였으며, 평균값 및 표준편차는 소수점 이하에서 반올림하였다.

2) 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상 실험

(1) 음성 대조 물질

시험물질을 200 mg/mL 멸균증류수에 10분 동안 vortex 용해하였고, 혼합했을 때에 발열, 발포, 변색이 없음을 확인하였다. 멸균증류수는 대한약품공업(주)의 제품을 사용하였고 상온(1~30℃)에서 보관하였다.

(2) 양성 대조 물질

2 mg/vial 함량의 mitomycin C, 98.0% 순도의 cyclophosphamide monohydrate (CPA)을 사용하였다. 모두 Sigma-Aldrich Co. 제품을 사용하였으며 모두 냉장환경(2~8℃)에서 보관하였다.

(3) 실험 세포

American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA)에서 입수한 CHL/IU (Female, Chinese Hamster Lung 유래)를 사용하였다. DMSO를 10% (v/v)의 비율로 첨가한 배지에 세포를 부유시켜 약 1 mL씩 분주하였으며, 액체질소 보존용기에 옮겨 동결 보존하였다. 보존된 동결 세포는 시험 기간 중 해동 및 배양하여 사용되었으며, 다른 시험과 공통으로 사용하였다.

입수 후 동결 보존한 세포에 해동 후 시험에 사용하기 전에 염색체모드(2n)는 25, 배가시간이 15.9시간, mycoplasma의 음성 상태를 확인하였다.

(4) Minimum essential medium (MEM) 배지

MEM 배지 및 MEM은 사전 혹은 시험 개시 후에 구입, 조제하였으며 다른 시험과 공통으로 사용하였다.

MEM에 heat-inactivated fetal bovine serum (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 10% (v/v), penicillin streptomycin (Gibco) 1% 비율로 첨가하였다.

(5) S9 mix (대사활성계)

S9은 SD rat (수컷)에 Aroclor1254를 500 mg/kg의 농도로 복강 내 단회 투여하여 효소를 유도한 뒤 5일째에 간으로부터 조제하였다. 멸균증류수 2.1 mL와 동결건조된 S9 1 vial을 혼합하여 현탁하였다.

Cofactor mix는 제조원 Oriental Yeast Co.의 Cofactor-I에 멸균증류수 7 mL를 넣어 용해한 후 pore size 0.45 μm의 membrane filter로 여과한 것을 Cofactor mix한 것으로 사용 시 조제하였다. S9 mix는 Cofactor mix 4.9 mL당 S9 2.1 mL의 비율로 추가하여 S9 mix로 하였다. S9 mix는 사용 시 조제하고 사용할 때까지 냉장 보존(2~8℃)하였다.

(6) 농도 결정 실험

단기간처리법(-S9 mix, +S9 mix)과 연속처리법(24시간 처리)으로 조건을 나눠서 실험하였다. 가이드라인에서 규정하고 있는 최고 농도 5,000 µg/plate로 하여 313, 625, 1,250, 2,500, 5,000 (μg/plate)로 구별하여 설정하였다. 농도결정시험 결과, 생세포 수의 급격한 감소로 인하여 본 실험의 최고농도 설정에 어려움이 있어 -S9 mix와 24시간 처리는 1,100, 1,200, 1,250, 1,300, 1,400 (μg/plate)으로 농도를 구별하였다. 또한 +S9 mix는 2,000, 2,250, 2,500, 2,750, 3,000으로 농도를 구별하였다. 농도결정시험 결과를 토대로 relative increase in cell counts (RICC) 55를 넘는 농도를 각 처리조건에서 최고농도로 하여 -S9 mix는 300, 600, 1,200, 1,250, 1,300 (μg/plate)의 농도로 구별하고, +S9 mix는 600, 1,200, 2,400, 2,500, 2,600 (μg/plate)의 농도로 구별하여 실험하였다.

(7) 표본 제작

Colcemid를 최종농도 0.2 μg/mL이 되도록 각 culture flask에 첨가하여 처리종료 2시간 전에 분열중기세포를 축적하였다. 처리 종료 후 세포 표면을 phosphate buffered saline (-)로 세정하고, 0.25% trypsin-ethylenediaminetetraacetic acid로 처리(37℃, 5분)하여 세포를 박리하였다. 원심관에서 세포부유액을 회수해 원심분리(5분간, 1,000 rpm; 이하 동일)하여 세포를 모았으며, 상등액을 제거한 후 각 원심관에 0.075 mol/L 농도의 KCL 용액 4 mL을 넣고 저장처리(15분, 37℃)한 뒤, 0.5 mL의 냉각한 고정액(메탄올:빙초산 혼합액[3:1, v/v])을 첨가하여 혼합한 후 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 여기에 4 mL의 고정액를 혼합한 후에 원심분리하여 상등액을 제거하는 과정을 재차 실시한 후 적당량의 고정액으로 세포를 부유시킨 뒤 slide tray 위에 둔 slide glass에 2-3개소에 떨어뜨려 건조시켜 culture flask당 2매 이상의 표본을 제작하였다.

(8) 판단 기준

① 구조이상

염색분체형절단, 염색분체형교환, 염색체형절단, 염색체형교환(이동원체, 환상염색체 등), 단편화를 구조 이상으로 판단하였다.

② Gap

염색분체의 폭보다 염색분체로 보여지는 비염색 부분의 폭이 좁은 것을 gap으로 판단하였다. 구조 이상에는 포함하지 않았으며, 다른 이상과 구별해 기록하였다.

③ 수적 이상

동원체수가 35 이상의 배수성 세포, 핵내배가 세포의 수적 이상으로 판단하였다.

④ 염색체 이상세포

염색체 구조 이상을 1개 이상 가지는 세포 또는 염색체 수적 이상을 가지는 세포를 염색체 이상세포로 판정하였다. 이 때, 관찰 가능한 분열 중기 세포는 culture flask 당 150개(농도 당 300개)의 세포를 채용 데이터로 선정하였다.

3) 포유류 골수세포를 이용한 소핵 실험

본 시험은 동물보호법[시행 2018-09-21][법률 제15502호(2018-03-20, 일부개정)] 및 실험동물에 관한 법률[시행 2019-03-25][법률 제16075호(2018-12-24, 일부개정)]에 근거하여 시행되었으며, (재)한국화학융합 시험연구원 화순의 동물윤리위원회에 의해 승인되었다(승인번호: IAC2019-1142).

(1) 음성 대조 물질 선정

시험물질을 200 mg/mL 멸균증류수에 10분 동안 vortex 용해하였고, 혼합했을 때에 발열, 발포, 변색이 없음을 확인하였다. 멸균증류수는 대한약품공업(주)의 제품을 사용하였고 상온(1~30℃)에서 보관하였다.

(2) 양성 대조 물질 선정

제조원 Sigma-Aldrich Co.의 CPA를 사용하였으며 냉장조건(2~8℃)에서 보관하였다.

(3) 실험동물

① 시험계

(주)오리엔트 바이오(성남, 한국)에서 공급받은 CD1 계통의 ICR mouse를 사용하였다. 용량결정 실험 도입 시에는 체중 22.57~25.72 g의 6주령 암컷과 체중 26.91~30.60 g의 6주령 수컷을 18마리 사용하였다. 또한 용량결정 실험 투여 시에는 체중 27.79~30.43 g의 7주령 암컷과 체중 34.61~36.98 g의 6주령 수컷을 15마리 사용하였다.

본 실험 도입 시에는 체중 27.03~30.14 g의 6주령 수컷을 28마리 사용하였다. 또한 본 실험의 투여 시에는 체중 33.39~36.59 g의 7주령 수컷을 25마리 사용하였다.

② 사육환경

Stainless steel cage (180W×300D×140H) mm에 평균 온도 (21.6~22.4)℃, 상대습도 (53.7~56.7)%, 광조건 12시간(08:00~20:00) 암조건 12시간(20:00~08:00), 조도(150~300) Lux의 조명주기, 환기횟수(10~20)회/h의 사육환경을 유지하였으며, 음수는 R/O수, 사료는 방사선 멸균된 Rodent Diet 20 5053 (Labdiet, St. Louis, MO, USA)를 자유 섭취시켰다.

(4) 투여

투여 전 약 3~4시간 절식시킨 실험동물에 경구 투여용 sonde를 이용하여 시험물질을 위 내에 강제 투여하였다. 양성대조물질은 시험물질 2회차 투여일에 복강 내 투여하였다. 24시간 간격으로 2회 강제 경구 투여하였다.

① 용량 설정 실험

Table II와 같이 군당 3마리의 마우스를 암컷과 수컷으로 구별하여 시험물질 투여군 4군 및 음성대조군 1군의 총 5군으로 실험하였다.

Table Ⅱ. Capacity Setting Test in ICR Mice (Group Summary).

Sex Group Dose Times Route Numbers of animals
Male G1 Negative control 2 Oral 3 (1101-1103)
G2 500 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (1201-1203)
G3 1,000 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (1301-1303)
G4 1,500 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (1401-1403)
G5 2,000 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (1501-1503)
Female G6 Negative Control 2 Oral 3 (2101-2103)
G7 500 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (2201-2203)
G8 1,000 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (2301-2303)
G9 1,500 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (2401-2403)
G10 2,000 mg/kg⋅B.W./day 2 Oral 3 (2501-2503)


② 본 실험

용량설정시험 결과, 암컷 및 수컷 간의 시험물질에 대한 감수성 차이는 확인되지 않았고, 최고 농도인 2,000 mg/kg⋅B.W./day군에서도 사망 사례가 없었으므로 본 시험에서는 수컷 마우스에 최고 농도를 2,000 mg/kg⋅B.W./day로 하여 Table III과 같이 투여하였다.

Table Ⅲ. Capacity Setting Test in ICR Mice (Group Summary).

Division Dose(mg/kg⋅B.W./day) Concentration(mg/mL) Volume(mL/kg once) Times Route Numbers of animals
Negative control 0 0 10 2 Oral 5 (1101-1105)
500 50 10 2 Oral 5 (1201-1205)
Test substance 1,000 100 10 2 Oral 5 (1301-1305)
2,000 200 10 2 Oral 5 (1401-1405)
Positive control 70 7 10 1 Intraperitoneal 5 (1501-1505)


(5) 관찰항목

일반증상관찰 투여 당일과 부검 당일 1회 이상 관찰하였다. 표준작업지침서 방법에 따라 체중측정 실험동물 도입 시, 군 분리 전, 투여 전 및 부검 전에 개별 체중을 측정하였다.

(6) 소핵의 판정기준

① 다염성 적혈구의 구별

관찰 시야에서 핵이 없이 적색 형광을 보이는 것으로 하였다.

② 정염성 적혈구의 구별

관찰 시야에서 형광을 전혀 나타내지 않고 음영으로만 구분되며 다염성 적혈구 크기인 것으로 하였다.

③ 소핵의 판정기준

크기는 제일 작은 것은 식별이 가능한 것으로, 제일 큰 것은 적혈구 직경의 1/2까지로 하였다. 형태는 주로 원형이나 기타 반원형, 도너츠형 등의 형태의 것을 포함시켰다. 색깔은 근접한 유핵세포의 핵과 동일하게 녹색 형광을 띠는 것으로 하였다.

(7) 자료의 통계처리

통계 처리는 SPSS program (Ver. 19; IBM Co., Armonk, NY, USA)을 이용하여 실시하였다. 소핵유발빈도에 있어 음성대조군과 시험물질 투여군 간의 비교는 Kruskal- Wallis' H-test 통계법을 사용하였다. 소핵유발빈도에 있어서 음성대조군과 양성대조군 간의 비교는 Mann-Whitney's U-test를 사용하였으며, 전체적혈구 중 다염성 적혈구의 비율(polychromatic erythrocyte [PCE]/[PCE+normochromatic erythrocyt {NCE}])에서 음성대조군과 시험물질 투여군 간의 비교(양성대조군 포함)는 one-way analysis of variance (ANOVA) test와 Dunnett's test를 사용하였다. 전체적혈구 중 다염성 적혈구의 비율[(PCE/(PCE+NCE)]에 있어서 음성대조군과 양성대조군의 비교는 Student's t-test를 사용하였고, 체중에 있어 부검 시 각 개체의 체중에 대해서는 Dunnett's test와 ANOVA test를 실시하여 부검 시 군간 차이를 조사하였다.

결과»»»

1. 박테리아를 이용한 복귀 돌연변이 실험

대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA98 및 TA1537 균주에서 2배 이상 콜로니의 증가양상이 확인되었고 TA100 균주에서 1.8배의 콜로니 증가양상이 확인되었다. 생육저해는 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았으며, 시험물질의 석출도 대사활성계 적용 유무에 관계없이 모든 농도에서 확인되지 않았다(Tables IV, V).

Table Ⅳ. Result of Concentration Range-Finding Test (Group Summary).

Tester strain Chemical treated Dose (μg/plate) Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor]*


Without S9 mix With S9 mix
TA98 Negative control 0 27±3 32±5
Test solution 50 25±4 [0.9] 34±5 [1.1]
150 25±4 [0.9] 34±2 [1.1]
500 23±3 [0.9] 31±2 [1.0]
1,500 27±3 [1.0] 31±2 [1.0]
5,000 77±8 [2.9] 30±2 [0.9]

TA100 Negative control 0 117±6 132±2

Test solution 50 119±5 [1.0] 130±4 [1.0]
150 116±6 [1.0] 140±1 [1.1]
500 118±2 [1.0] 135±7 [1.0]
1,500 116±5 [1.0] 133±2 [1.0]
5,000 205±33 [1.8] 136±2 [1.0]

TA1535 Negative control 0 11±3 10±1

Test solution 50 10±3 [0.9] 11±3 [1.0]
150 9±2 [0.9] 9±2 [0.8]
500 10±3 [1.0] 12±2 [1.2]
1,500 11±2 [1.0] 10±0 [1.0]
5,000 12±2 [1.2] 11±3 [1.1]

TA1537 Negative control 0 9±2 11±2

Test solution 50 11±1 [1.2] 11±2 [1.0]
150 11±3 [1.1] 11±1 [1.0]
500 11±2 [1.2] 11±2 [1.0]
1,500 11±1 [1.2] 11±1 [1.0]
5,000 24±4 [2.6] 11±1 [1.1]

WP2uvr A Negative control 0 47±5 63±4

Test solution 50 49±3 [1.0] 60±3 [1.0]
150 45±4 [0.9] 57±3 [0.9]
500 45±1 [1.0] 62±3 [1.0]
1,500 45±3 [1.0] 62±5 [1.0]
5,000 47±2 [1.0] 55±3 [0.9]

Positive controls

TA98 AF-2 0.1 507±13 [23.0]
TA100 AF-2 0.01 457±4 [4.1]
TA1535 NaN3 0.5 367±8 [34.4]
TA1537 9-AA 40.0 270±12 [27.0]
WP2uvrA AF-2 0.01 388±5 [8.3]
TA98 B(a)P 2.5 275±6 [8.3]
TA100 B(a)P 2.5 1,106±48 [8.2]
TA1535 2-AA 2.0 183±5 [17.7]
TA1537 2-AA 2.0 201±7 [17.7]
WP2uvrA 2-AA 10.0 368±3.5 [6.7]

S.D.: standard deviation, AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN3: sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene..

*No. of colonies of treated plate/No. of colonies of negative control plate..


Table Ⅴ. Result of Concentration Range-Finding Test (Individual Summary).

Tester strain Chemical treated Dose (μg/plate) Colonies/plate (Plate A, B and C)*


Without S9 mix With S9 mix
TA98 Negative control 0 29 24 28 32 27 36

Test solution 50 29 22 25 37 37 29
150 28 21 27 32 36 35
500 24 26 20 32 29 32
1,500 24 26 30 30 30 34
5,000 79 69 84 31 27 31

TA100 Negative control 0 123 112 115 131 130 134

Test solution 50 116 117 125 141 139 141
150 111 122 115 141 139 141
500 116 119 120 138 127 141
1,500 112 122 115 132 132 136
5,000 194 179 243 136 137 134

TA1535 Negative control 0 9 9 14 11 10 10

Test solution 50 8 8 13 13 12 7
150 11 8 9 7 10 9
500 12 7 12 11 14 11
1,500 13 11 9 10 10 10
5,000 14 10 13 8 12 14

TA1537 Negative control 0 8 8 12 9 13 10

Test solution 50 12 10 11 13 9 11
150 8 10 14 12 10 10
500 10 13 11 12 12 8
1,500 11 10 12 10 10 12
5,000 21 28 23 11 11 12

WP2uvrA Negative control 0 42 48 52 58 64 66

Test solution 50 46 52 49 63 61 57
150 41 44 49 53 59 58
500 46 45 44 65 62 59
1,500 42 45 48 63 66 57
5,000 46 49 47 52 57 56

Positive controls

TA98 AF-2 0.1 516 508 482
TA100 AF-2 0.01 467 458 453
TA1535 NaN3 0.5 367 374 359
TA1537 9-AA 40.0 280 272 269
WP2uvrA AF-2 0.01 395 379 382
TA98 B(a)P 2.5 285 290 272
TA100 B(a)P 2.5 952 897 1,012
TA1535 2-AA 2.0 186 194 192
TA1537 2-AA 2.0 208 204 192
WP2uvrA 2-AA 10.0 384 370 369

AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN3: sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene..

*No. of colonies of treated plate/No. of colonies of negative control plate..



2) 본 실험

대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA100 및 TA1537 균주에서 콜로니의 증가양상이 확인되었다. 생육저해는 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았으며, 시험물질의 석출도 대사활성계 적용 유무에 관계없이 모든 농도에서 확인되지 않았다(Tables VI, VII).

Table Ⅵ. Result of Main Test (Group Summary).

Tester strain Chemicaltreated Dose(μg/plate) Colonies/plate (Mean±S.D.) [Factor]*


Without S9 mix With S9 mix
TA98 Negative control 0 22±3 33±4

Test solution 1,000 27±1 [1.2] 33±4 [1.0]
2,000 22±1 [1.0] 33±3 [1.0]
4,000 24±2 [1.1] 36±2 [1.1]
6,000 34±8 [1.6] 36±3 [1.1]
8,000 39±9 [1.8] 33±4 [1.0]
10,000 46±3 [2.1] 32±3 [1.0]

TA100 Negative control 0 112±6 136±6

Test solution 1,000 121±3 [1.1] 134±3 [1.0]
2,000 151±21 [1.3] 135±5 [1.0]
4,000 205±11 [1.8] 133±4 [1.0]
6,000 226±15 [2.0] 133±5 [1.0]
8,000 266±47 [2.4] 134±4 [1.0]
10,000 367±31 [3.3] 134±3 [1.0]

TA1535 Negative control 0 11±1 10±4

Test solution 1,000 9±2 [0.9] 11±3 [1.1]
2,000 10±2 [0.9] 12±2 [1.1]
4,000 11±2 [1.0] 11±1 [1.1]
6,000 12±2 [1.2] 10±2 [1.0]
8,000 13±2 [1.2] 11±2 [1.1]
10,000 11±3 [1.0] 10±2 [0.9]

TA1537 Negative control 0 10±2 11±2

Test solution 1,000 10±2 [1.0] 11±2 [0.9]
2,000 10±0 [1.0] 10±3 [0.9]
4,000 10±1 [1.0] 13±2 [1.1]
6,000 22±3 [2.2] 11±2 [0.9]
8,000 33±2 [3.3] 10±3 [0.9]
10,000 42±7 [4.2] 9±3 [0.8]

WP2uvrA Negative control 0 47±5 55±3

Test solution 1,000 46±2 [1.0] 56±3 [1.0]
2,000 45±4 [1.0] 58±4 [1.1]
4,000 45±5 [1.0] 54±4 [1.0]
6,000 47±1 [1.0] 56±3 [1.0]
8,000 46±3 [1.0] 54±3 [1.0]
10,000 47±4 [1.0] 55±4 [1.0]

Positive controls

TA98 AF-2 0.1 507±13 [23.0]
TA100 AF-2 0.01 457±4 [4.1]
TA1535 NaN3 0.5 367±8 [34.4]
TA1537 9-AA 40.0 270±12 [27.0]
WP2uvrA AF-2 0.01 388±5 [8.3]
TA98 B(a)P 2.5 275±6 [8.3]
TA100 B(a)P 2.5 1,106±48 [8.2]
TA1535 2-AA 2.0 183±5 [17.7]
TA1537 2-AA 2.0 201±7 [17.7]
WP2uvrA 2-AA 10.0 368±3.5 [6.7]

S.D.: standard deviation, AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN3: sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene..

*No. of colonies of treated plate/No. of colonies of negative control plate..


Table Ⅶ. Result of Main Test (Individual Summary).

Tester strain Chemical treated Dose (μg/plate) Colonies/plate (Plate A, B and C)*


Without S9 mix With S9 mix
TA98 Negative control 0 21 20 25 38 32 30

Test solution 1,000 28 28 26 29 36 34
2,000 22 22 23 37 32 31
4,000 22 24 25 35 34 38
6,000 26 41 36 36 39 33
8,000 33 34 49 30 32 38
10,000 47 49 43 35 30 31

TA100 Negative control 0 118 107 111 135 142 130

Test solution 1,000 125 120 119 131 137 134
2,000 158 167 127 135 139 130
4,000 204 216 194 129 136 134
6,000 216 243 219 128 138 133
8,000 220 314 265 130 135 138
10,000 402 354 345 131 137 135

TA1535 Negative control 0 12 10 10 10 14 7

Test solution 1,000 11 10 7 8 12 13
2,000 10 12 8 11 14 10
4,000 9 12 11 12 12 10
6,000 14 11 12 8 12 11
8,000 11 13 14 10 14 10
10,000 7 13 12 8 9 12

TA1537 Negative control 0 8 10 12 11 10 13

Test solution 1,000 12 11 8 12 12 8
2,000 10 10 10 7 12 10
4,000 10 10 9 13 11 14
6,000 19 21 25 9 12 11
8,000 33 35 32 13 10 8
10,000 49 36 40 12 7 9

WP2uvrA Negative control 0 48 42 51 58 52 54

Test solution 1,000 46 44 47 55 53 59
2,000 44 50 42 54 58 62
4,000 42 43 51 52 58 51
6,000 48 47 47 55 59 54
8,000 43 49 45 53 52 58
10,000 44 46 52 51 58 55

Positive controls

TA98 AF-2 0.1 519 494 508
TA100 AF-2 0.01 457 460 453
TA1535 NaN3 0.5 367 374 359
TA1537 9-AA 40.0 284 262 264
WP2uvrA AF-2 0.01 392 383 390
TA98 B(a)P 2.5 282 273 270
TA100 B(a)P 2.5 1,143 1,052 1,124
TA1535 2-AA 2.0 179 183 188
TA1537 2-AA 2.0 195 199 208
WP2uvrA 2-AA 10.0 368 371 364

AF-2: 2-(2-furyl)-3-(5-nitro-2-furyl)acrylamide, NaN3: sodium azide, 9-AA: 9-aminoacridine, B(a)P: Benzo(a)pyrene, 2-AA: 2-aminoanthracene..

*No. of colonies of treated plate/No. of colonies of negative control plate..



3) 무균 실험

농도결정시험에서 S9 mix 및 최고농도의 시험물질 조제액은 세균과 곰팡이의 오염이 관찰되지 않았고, 본 시험에서도 S9 mix 및 최고농도의 시험물질 조제액은 세균과 곰팡이의 오염이 관찰되지 않았다.

2. 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상 실험

1) 농도 결정 실험

시험물질 처리 개시 시에 시험물질에 침전이 없음을 확인하였다.

시험물질의 세포독성은 농도의존적으로 증가하였다. 세포독성 지표인 상대세포수 증가(RICC) (55±5)%는 -S9 mix에서는 1,218.92 μg/mL, +S9 mix에서는 2,522.53 μg/mL, 24시간 처리에서는 1,234.04 μg/mL이었다(Tables VIII, IX).

Table Ⅷ. Results of Concentration Range Finding Test I.

Concentration (μg/mL) Short-term treatment test Continuous treatment test


Without S9 mix (%) With S9 mix (%) 24 hours exposure
0 100.00 100.0 100.00
313 90.33 87.17 108.95
625 83.25 87.53 102.77
1,250 49.08 90.61 53.85
2,500 1.78 49.87 0
5,000 0 31.44 0

Table Ⅸ. Results of Concentration Range Finding Test II.

Concentration (μg/mL) Short-term treatment test Continuous treatment test


Without S9 mix (%) Concentration (μg/mL) With S9 mix (%) Concentration (μg/mL) 24 hours exposure
0 100.00 0 100.0 0 100.00
1,100 84.54 2,000 64.53 1,100 65.64
1,200 69.29 2,250 76.09 1,200 62.35
1,250 51.41 2,500 56.73 1,250 51.84
1,300 46.12 2,750 40.23 1,300 51.47
1,400 44.61 3,000 21.26 1,400 52.48
RICC55 1,218.92 μg/mL RICC55 2,522.53 μg/mL RICC55 1,234.04 μg/mL

RICC: relative increase in cell counts..



2) 염색체 이상 실험(단시간처리법)

시험물질 처리 개시 시에 시험물질의 침전은 확인되지 않았다.

표본관찰 결과, -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/mL 농도에서 염색체구조이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0%로 관찰되었으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다. 그리고 +S9 mix의 0, 600, 1,200, 2,400, 2,500 및 2,600 μg/mL에 있어서의 염색체구조이상세포의 출현빈도는 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.3%로 관찰되었으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다.

각 처리조건의 음성대조군에서 수적이상세포 및 구조이상세포의 출현빈도는 5% 미만으로 확인되었고, 양성대조군에서 구조이상세포의 출현빈도는 10% 이상으로 확인되었다(Tables X, XI).

Table Ⅹ. Result of Chromosomal Aberration Test (Short-Term Treatment Test, -S9 Mix).

Treatment recovery period (h) S9 mix Concentration (μg/mL) Number of observed Number of structural aberrations (Frequencies %) Total (cells %) g Cell growth index (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Total (cells %)


ctb cte csb cse other Number of observed Polyploids Endo
6-18 - Negative control (SDW) 150 0 0 0 0 0 0 0 100.8 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 99.2 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - 300 150 0 0 0 0 0 0 0 100.6 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 90.7 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 95.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - 600 150 0 0 0 0 0 0 0 84.9 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 83.4 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 84.2 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 53.5 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 51.9 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 52.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - 1,250 150 0 0 0 0 0 0 0 47.7 150 0 0 0
150 0 1 0 0 0 1 0 50.3 150 0 0 0
300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 49.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - 1,300 150 0 0 0 0 0 0 0 37.0 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 43.4 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 40.2 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 - Positive control (MMC 0.1) 150 5 26 1 2 0 34 0 150 0 0 0
150 4 27 2 2 0 35 1 150 0 0 0
300 9 (3.0) 53 (17.7) 3 (1.0) 4 (1.3) 0 (0.0) 69 (23.0) 1 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, -: without metabolic activation, SDW: sterile distilled water, MMC: mitomycin C..


Table Ⅺ. Result of Chromosomal Aberration Test (Short-Term Treatment Test, +S9 Mix).

Treatment recovery period (h) S9mix Concentration(μg/mL) Numberofobserved Number of structural aberrations(Frequencies %) Total(cells %) g Cellgrowthindex (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Total(cells %)


ctb cte csb cse other Numberofobserved Polyploids Endo
6-18 + Negative control (SDW) 150 0 0 0 0 0 0 1 97.3 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 102.8 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + 600 150 0 0 0 0 0 0 0 88.6 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 113.0 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 100.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 118.9 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 94.1 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 106.5 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + 2,400 150 0 0 0 0 0 0 0 77.2 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 76.4 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 76.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + 2,500 150 0 1 0 0 0 1 0 66.2 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 56.0 150 0 0 0
300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 61.1 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + 2,600 150 0 1 0 0 0 1 0 57.6 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 55.6 150 0 0 0
300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 56.6 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
6-18 + Positive control (CPA 5) 150 2 27 1 3 0 33 0 150 0 0 0
150 3 25 4 0 0 32 0 150 0 0 0
300 5 (1.7) 52 (17.3) 5 (1.7) 3 (1.0) 0 (0.0) 65 (21.7) 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, +: with metabolic activation, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..



3) 염색체 이상 실험(24시간 처리법)

시험물질 처리 개시 시에 시험물질의 침전은 확인되지 않았다.

표본관찰 결과, 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/mL에 있어서의 염색체구조이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.3, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0%로 관찰되었고 염색체수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다. 음성대조군의 경우 구조이상세포 및 수적이상세포의 출현빈도는 5% 미만으로 확인되었고, 양성대조군의 경우 구조이상세포의 출현빈도는 10% 이상으로 확인되었다(Table XII).

Table Ⅻ. Result of Chromosomal Aberration Test (Continuous Treatment Test, -S9 Mix).

Treatment recovery period (h) S9mix Concentration(μg/mL) Numberofobserved Number of structural aberrations(Frequencies %) Total(cells %) g Cellgrowthindex (%) Number of numerical aberrations (Frequencies %) Total(cells %)


ctb cte csb cse other Number of observed Polyploids Endo
24-0 - Negative control (SDW) 150 0 0 0 0 0 0 1 105.0 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 95.0 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 100.0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - 300 150 0 0 0 0 0 0 0 88.3 150 0 0 0
150 0 1 0 0 0 1 0 90.5 150 0 0 0
300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 89.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - 600 150 0 0 0 0 0 0 0 83.5 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 96.1 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 89.8 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - 1,200 150 0 0 0 0 0 0 0 53.4 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 60.1 150 0 0 0
300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 56.7 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - 1,250 150 0 0 0 0 0 0 0 50.1 150 0 0 0
150 1 0 0 0 0 1 0 56.7 150 0 0 0
300 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 53.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - 1,300 150 0 0 0 0 0 0 0 43.4 150 0 0 0
150 0 0 0 0 0 0 0 53.4 150 0 0 0
300 0 (0.0) 1 (0.3) 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0) 1 (0.3) 0 48.4 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)
24-0 - Positive control (MMC 0.05) 150 3 29 1 1 0 34 0 150 0 0 0
150 2 27 2 1 0 32 0 150 0 0 0
300 5 (1.7) 56 (18.7) 3 (1.0) 2 (0.7) 0 (0.0) 66 (22.0) 0 300 0 (0.0) 0 (0.0) 0 (0.0)

ctb: chromatid type break, cte: chromatid type exchange, csb: chromoso-type break, cse: chromosome type exchange, other: fragmentation etc., g: gap, Endo: endoreduplication, -: without metabolic activation, SDW: sterile distilled water, MMC: mitomycin C..



3. 포유류 골수세포를 이용한 소핵 실험

1) 용량 설정 실험

용량설정시험 결과, 시험물질에 의한 일반증상 및 사망동물은 확인되지 않았다. 암컷과 수컷 간의 감수성의 차이가 확인되지 않았으므로 일반적으로 감수성이 뛰어나다고 알려져 있는 수컷 마우스를 본 시험의 시험동물로 사용하였다. 용량설정시험 결과를 토대로 본 시험에서 최고농도는 2,000 mg/kg⋅B.W./day로 설정하였다(Table XIII).

Table XIII. Clinical Signs and Mortalities (Group Summary).

Sex Chemical treated Dose (mg/kg⋅B.W./day) Mortality (dead/tatal)
Male Negative control (SDW) 0 0 % (0/3)*
Test substance 500 0 % (0/3)
Test substance 1,000 0 % (0/3)
Test substance 1,500 0 % (0/3)
Positive control (CPA) 2,000 0 % (0/3)
Female Negative control (SDW) 0 0 % (0/3)*
Test substance 500 0 % (0/3)
Test substance 1,000 0 % (0/3)
Test substance 1,500 0 % (0/3)
Positive control (CPA) 2,000 0 % (0/3)

SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..

*No. of dead animals/No. of tested animals.



2) 본 실험

(1) 체중

모든 투여군에서 음성대조군 대비 통계학적 유의성을 가진 체중변화는 관찰되지 않았다(Tables XIV, XV).

Table XIV. Body Weight of Animals (Group Summary).

Sex Chemical treated Dose(mg/kg⋅B.W./day) Body weights (mean±S.D.; g) at the time of adiministration (No. of animal)


1st 2nd Sacrifice(No. of animal)
Male Negative control (SDW) 0 34.92±0.57 (5) 34.93±0.74 (5) 34.84±0.76 (5)
Test substance 500 35.09±1.23 (5) 34.24±1.35 (5) 34.09±1.20 (5)
Test substance 1,000 34.81±0.83 (5) 34.61±0.85 (5) 34.21±0.52 (5)
Test substance 2,000 35.19±0.93 (5) 34.98±1.08 (5) 34.46±1.25 (5)
Positive control (CPA) 70 35.25±0.55 (5) 35.22±0.76 (5) 34.94±0.48 (5)

S.D.: standard deviation, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..


Table XV. Body Weight of Animals (Individual Data, Male).

Chemical treated Dose (mg/kg⋅B.W./day) Animal No. Body weights (g) at the time of Adiministration (No. of animal)


1st 2nd Sacrifice(No. of animal)
Negative control (SDW) 0 1101 35.20 35.12 34.01
1102 34.30 33.70 34.05
1103 34.64 34.87 35.28
1104 34.70 35.38 35.17
1105 35.75 35.57 35.67
Test substance 500 1201 35.74 35.13 34.37
1202 33.39 33.09 32.62
1203 35.30 34.62 34.63
1204 36.59 35.77 35.64
1205 34.44 32.59 33.20
Test substance 1,000 1301 35.49 35.63 34.37
1302 33.84 34.36 34.69
1303 34.94 34.68 34.31
1304 35.70 35.04 34.38
1305 34.06 33.34 33.32
Test substance 2,000 1401 34.89 35.60 34.29
1402 36.23 36.60 36.62
1403 35.41 34.12 33.71
1404 33.78 34.37 34.16
1405 35.66 34.22 33.51
Positive control (CPA) 70 1501 34.34 33.94 34.51
1502 35.52 35.18 34.61
1503 35.13 35.50 34.76
1504 35.71 35.91 35.69
1505 35.55 35.57 35.13

SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..



(2) 일반 증상

본 시험의 시험군 중 사망동물은 관찰되지 않았다(Tables XVI, XVII).

Table XVI. Clinical Signs and Mortalities (Group Summary).

Sex Chemical treated Dose (mg/kg⋅B.W./day) Clinical signs Mortality (dead / tatal)
Male Negative control (SDW) 0 N 0% (0/5)*
Test substance 500 N 0% (0/5)
Test substance 1,000 N 0% (0/5)
Test substance 2,000 N 0% (0/5)
Positive control (CPA) 70 N 0% (0/5)

SDW: sterile distilled water, N: normal, CPA: cyclophosphamide monohydrate..

*No. of dead animals/No. of tested animals..


Table XVII. Clinical Signs and Mortalities (Individual Data, Male).

Chemical treated Dose (mg/kg⋅B.W./day) Animal No. Clinical signs
Negative control (SDW) 0 1101 Normal
1102 Normal
1103 Normal
1104 Normal
1105 Normal
Test substance 500 1201 Normal
1202 Normal
1203 Normal
1204 Normal
1205 Normal
Test substance 1,000 1301 Normal
1302 Normal
1303 Normal
1304 Normal
1305 Normal
Test substance 2,000 1401 Normal
1402 Normal
1403 Normal
1404 Normal
1405 Normal
Positive control (CPA) 70 1501 Normal
1502 Normal
1503 Normal
1504 Normal
1505 Normal

SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..



(3) 소핵 출현빈도 및 총적혈구 비율

4,000개 이상의 다염성적혈구를 부검하여 관찰한 결과, 음성대조군의 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 (0.12±0.02)%이었으며, 500 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 소핵출현빈도는 (0.08±0.02)%, 1,000 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 빈도는 (0.09±0.01)%, 2,000 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 빈도는 (0.10±0.03)%, 양성대조군의 빈도는 (6.40±0.40)%를 나타내었다. 시험물질을 투여한 각 군에서 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 발생빈도는 음성대조군 대비 증가하지 않았으며, 통계적으로 유의한 차이 또한 없었다. 반면 양성대조군의 소핵출현빈도는 음성대조군에 비해 현저한 증가를 보였으며, 통계학적으로 유의한 수준이었다(p<0.05).

세포독성의 지표인 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은 위와 같은 순서로 평균 (49.68±1.49)%, (51.31±0.71)%, (50.46±1.18)%, (50.92±1.01)% 및 (42.58±1.39)%이었으며, 모든 투여군에서 음성대조군 대비 통계학적으로 유의한 차이가 없었다. 한편 양성대조군의 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은 음성대조군에 비해 통계학적으로 유의한 차이가 나타났다(p<0.05)(Tables XVIII, XIX).

Table XVIII. Micronucleus Test in ICR Mice (Group Summary).

Sex Chemical treated Dose(mg/kg⋅B.W./day) No. of animal MNPCE/4000PCEs (Mean±S.D., %) PCE/(PCE+NCE) (Mean±S.D., %)
Male Negative control (SDW) 0 5 0.12±0.02 49.68±1.49
Test substance 500 5 0.08±0.02 51.31±0.71
Test substance 1,000 5 0.09±0.01 50.46±1.18
Test substance 2,000 5 0.10±0.03 50.92±1.01
Positive control (CPA) 70 5 6.40±0.40* 42.58±1.39*

MNPCE: PCE with one or more micronuclei, PCE: polychromatic erythrocyte, S.D.: standard deviation, NCE: normochromatic erythrocyte, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..

*Significant difference as compared with control (p<0.05)..


Table XIX. Micronucleus Test in ICR Mice (Individual Data, Male).

Chemical treated Dose(mg/kg⋅B.W./day) Animal No. PCE's MNPCE Frequency of MNPCE (%) No. of PCE / NCE PCE/ (PCE+NCE)
Negative control (SDW) 0 1101 4,000 5 0.13 279 / 283 49.64
1102 4,000 4 0.10 289 / 264 52.26
1103 4,000 6 0.15 277 / 289 48.94
1104 4,000 5 0.13 284 / 296 48.97
1105 4,000 4 0.10 273 / 289 48.58
Test substance 500 1201 4,000 3 0.08 288 / 285 50.26
1202 4,000 2 0.05 275 / 253 52.08
1203 4,000 3 0.08 284 / 267 51.54
1204 4,000 4 0.10 285 / 274 50.98
1205 4,000 4 0.10 277 / 259 51.68
Test substance 1,000 1301 4,000 3 0.08 279 / 267 51.10
1302 4,000 3 0.08 288 / 295 49.40
1303 4,000 4 0.10 279 / 261 51.67
1304 4,000 4 0.10 268 / 279 48.99
1305 4,000 4 0.10 274 / 262 51.12
Test substance 2,000 1401 4,000 5 0.13 287 / 278 50.80
1402 4,000 5 0.13 281 / 264 51.56
1403 4,000 3 0.08 275 / 281 49.46
1404 4,000 3 0.08 295 / 287 50.69
1405 4,000 3 0.08 295 / 271 52.12
Positive control (CPA) 70 1501 4,000 251 6.28 249 / 316 44.07
1502 4,000 279 6.98 213 / 308 40.88
1503 4,000 249 6.23 231 / 309 42.78
1504 4,000 237 5.93 225 / 318 41.44
1505 4,000 263 6.58 251 / 323 43.73

PCE: polychromatic erythrocyte, MNPCE: PCE with one or more micronuclei, NCE: normochromatic erythrocyte, SDW: sterile distilled water, CPA: cyclophosphamide monohydrate..


고찰 및 결론»»»

최근 국제적으로 의약품 개발 시 임상 및 비임상시험에 대한 새로운 방법 및 데이터들이 제시되고 있으며, 보다 혁신적인 신약 개발을 가속화하기 위하여 의약품국제조화회의(International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use, ICH)에서는 2009년 비임상시험에 대한 가이드라인을 개정 발표하였다20). 이에 따라 의약품 개발은 동물과 사람에서 유효성과 안전성 정보를 평가하는 단계적 과정이라는 일반 원칙이 적용되므로21), 의약품의 안전성을 확인하기 위하여 일반독성시험, 면역독성시험, 생식발생독성시험, 유전독성시험 등 다양한 독성평가가 진행되어야 한다22).

이 중 유전독성이란 세포 또는 개체수준에서 돌연변이(mutation)를 유발하는 성질을 가리키는 개념에서 현재는 세포유전물질(DNA)에 상해성을 나타내는 성질(genotoxicity)을 포함하는 광범위한 의미로 이용되고 있으며3), 의약품 등의 유전독성시험은 ICH, 경제협력개발기구(Organisation for Economic Cooperation and Development, OECD) 및 식품의약품안전청 고시 제2017년-제71호의 가이드라인에 따라 크게 3가지로 구별되어 수행되고 있다1,2). 첫 번째, 유전자 돌연변이(gene mutation)를 지표로 하는 것과23) 두 번째, 염색체이상(chromosomal aberration)을 지표로 하는 것24) 그리고 세 번째, DNA에 대한 상해성 또는 수복성(DNA damage 또는 repair)을 지표로 하는 것이 그것이다1,21,25).

박테리아를 이용한 복귀돌연변이실험(Ames test, bacterial reverse mutation test)은 Salmonella Typhimurium LT2 strain에서 유래된 히스티딘 요구성 돌연변이주를 활용하여 복귀 돌연변이를 검출하는 시험법이다23). 포유류 배양세포를 이용한 염색체 이상 시험(in vitro chromosomal aberration assay)은 포유동물 세포를 배양한 Chinese hamster lung (CHL) 세포를 활용하여 대사활성계 적용 상태 및 비적용 상태에서 염색체형과 염색체분형의 교환(exchange) 및 절단(deletion)이 확인되는 염색체 이상의 계수를 통한 염색체 수나 구조의 변화를 보이는 중기상의 출현 빈도를 조사하여 염색체 이상 유발성 여부를 판정하는 연구이다24). 또한 마우스를 이용한 소핵시험(in vivo micronucleusassay)은 동물의 말초혈액 또는 골수세포를 사용하여 최종적인 유전독성을 판정하는 실험으로 소핵을 가진 다염성 적혈구의 증가 여부를 통해 시험물질에 의한 염색체 이상 유무를 평가하는 방법이다25).

박테리아를 이용한 ChondroT의 복귀돌연변이시험은 히스티딘 요구성인 Salmonella typhimurium TA100, TA1537, TA98, TA1535와 트립토판 요구성 Escherichia coli WP2uvrA (pKM101) 균주를 사용하였다. 농도결정시험의 결과, 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA98 및 TA1537 균주에서 2배 이상의 콜로니의 증가양상이 확인되었고, TA100 균주에서 1.8배의 콜로니 증가양상이 확인되었다. 생육저해는 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았으며, 시험물질의 석출도 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았다. 본 시험에서는 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA100 및 TA1537 균주에서 콜로니 수의 농도상관성(농도의존적 증가양상) 및 재현성을 더 정확하게 판단하기 위하여 최고농도를 10,000 μg/plate, 공차 2,000 μg/plate 및 공비 2를 적용하여 농도 1,000, 2,000, 4,000, 6,000, 8,000, 10,000(μg/plate)로 실험을 진행하였으며, 그 결과 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA100 및 TA1537 균주에서 콜로니의 증가양상이 확인되었다. 생육저해는 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았으며, 시험물질의 석출도 대사활성계 미적용(-S9 mix) 및 대사활성계 적용(+S9 mix) 모두에서 확인되지 않았다. 시험에서 생육저해는 4 농도 이상에서 관찰되지 않았으며, 5 농도 이상에서 평가가 가능했다.

복귀돌연변이시험에 사용된 TA1535와 TA100은 염기쌍 치환 돌연변이 물질인 hisG46을 포함하고 있어 point mutation을 평가에 사용되는 지표로서26) TA1535에서 복귀돌연변이의 절대 증가는 TA100에서 절대 증가를 초래하는 유사성을 가지고 있다27,28). 이 두 물질의 차이점은 TA100은 pKM101를 포함하고 있어 복귀돌연변이에 더 민감하게 작용하는 것이며, TA1535는 TA100과 달리 특정 3가지 화학물질(acetaldehyde oxime, 6-mercaptopurine, and 1,3-butadiene)에 더 민감하게 반응한다는 것이다29,30). 또한 시험에 사용된 TA98균주는 frame- shift mutation을 평가하는 지표로 알데히드기를 가진 유기체가 디클로로메틸 유기체(dichloromethyl group)로 교체될 때 민감하게 반응하는 특징이 있다31). ChondroT의 경우 대사활성계 미적용 상태에서 TA100과 TA1535 균주를 이용한 복귀돌연변이실험의 결과가 반대로 나왔으며, 발생된 복귀돌연변이 콜로니 수 또한 음성대조군에 비해 약 2배 수준에 불과하였다. 또한 대사활성계 적용 상태의 모든 균주가 복귀돌연변이 발생에 음성 반응을 보였으므로 추가 시험을 통해 복귀돌연변이 변이원성 보유여부를 판단해야 할 것으로 생각한다.

포유류배양세포를 이용한 ChondroT의 염색체 이상 시험은 CHL에서 유래된 배양세포를 통해 진행되었다. 농도결정시험에서 시험물질의 세포독성은 농도의존적으로 증가하였다. 세포독성 지표인 상대세포수 증가(RICC) (55±5)%는 -S9 mix에서는 1,218.92 μg/mL, +S9 mix에서는 2,522.53 μg/mL, 24시간 처리에서는 1,234.04 μg/mL이었다. 단시간 처리법을 통한 염색체 이상시험에서 -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/mL 농도에서 염색체구조이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0%로 관찰되었으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다. 또한 +S9 mix의 0, 600, 1,200, 2,400, 2,500 및 2,600 μg/mL에 있어서의 염색체구조이상세포의 출현빈도는 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.3%로 관찰되었으며, 수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다. 24시간 처리를 통한 염색체이상시험에서 -S9 mix 처리군의 0, 300, 600, 1,200, 1,250 및 1,300 μg/mL 농도에서 염색체구조이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.3, 0.0, 0.0, 0.3 및 0.0%로 관찰되었고 염색체수적이상세포의 출현빈도는 각각 0.0, 0.0, 0.0, 0.0, 0.0 및 0.0%로 관찰되었다.

음성대조군의 경우 구조이상세포 및 수적이상세포의 출현빈도는 5% 미만으로 확인되었고, 양성대조군의 경우 구조이상세포의 출현빈도는 10% 이상으로 확인되었다. -S9 mix 처리군과 +S9 mix 처리군 모두 염색체구조이상세포 및 수적이상세포의 출현빈도가 단시간처리법, 연속처리법에서 5% 미만이었으므로 본 시험조건 하에서 ChondroT는 CHL/IU세포에 대하여 염색체이상을 유발하지 않는 것이 확인되었다.

포유류 골수세포에 대한 ChondroT의 소핵 유발성 시험은 ICR 마우스를 통해 진행하였다. 본 시험 결과 모든 투여군에서 음성대조군에 비해 통계적으로 유의한 체중 차이가 관찰되지 않았고, 사망동물 또한 관찰되지 않았다. 개체 당 4,000개 이상의 다염성적혈구를 부검하여 관찰한 결과, 음성대조군의 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 (0.12±0.02)%이었으며, 500 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 소핵출현빈도는 (0.08±0.02)%, 1,000 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 빈도는 (0.09±0.01)%, 2,000 mg/kg⋅B.W./day 투여군의 빈도는 (0.10±0.03)%, 양성대조군의 빈도는 (6.40±0.40)%를 나타내었다. 시험물질을 투여한 각 군에서 다염성 적혈구 중 소핵을 갖는 적혈구의 출현빈도는 음성대조군과 비교하여 증가되는 경향이 없었으며, 통계적으로 유의한 차이 또한 없었다. 세포독성의 지표인 [PCE/(PCE+NCE)] 비율은 음성대조군, 500, 1,000, 2,000 mg/kg⋅B.W./day, 양성대조군의 순서로 평균 (49.68±1.49)%, (51.31±0.71)%, (50.46±1.18)%, (50.92±1.01)% 및 (42.58±1.39)%이었으며 모든 투여군에서 음성대조군 대비 통계학적으로 유의한 차이가 없었으므로, 본 시험조건 하에서 ChondroT는 수컷 ICR 마우스 골수세포에 대해 소핵을 유발하지 않는 것이 확인되었다.

이상의 결과에서 ChondroT는 In vitro 복귀돌연변이시험 중 대사활성계 미적용(-S9 mix)의 TA98 및 TA1537 균주에서 콜로니의 증가 양상이 확인되었으나, 대사활성계 적용(+S9 mix)의 환경에서 콜로니 증가가 없었고, 포유류 배양세포에서 염색체 이상을 유발하지 않았으며, 포유류 골수세포에 대해 소핵 유발이 없었다. 이는 시험물질 또는 그 대사활성물질이 골수에까지 도달하지 않았을 가능성이 높고21,23,32), ChondroT 구성 약재의 히스티딘 전구 물질 함유로 인한 히스티딘 유래의 TA98, TA1537 균주 콜로니 증가 양상이 의심되므로 향후 ChondroT의 복귀돌연변이 양성 소견에 대해서는 독성시험기준 해설서 가이드라인에 따라 코멧시험, 다중독성평가 등의23,32) 추가연구가 필요할 것으로 생각한다.

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January 2021, 31 (1)

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