“Syndrome X”라고도 불리는 대사증후군은 고혈압, 중심성 비만, 인슐린 저항성, 그리고 죽상경화성 이상지질혈증을 특징으로 하는 비정상적인 대사 상태를 말하며, 비만 유병률이 증가함에 따라 그 심각성이 대두되고 있다¹⁾. 특히, 대사증후군은 ‘인슐린 저항성 증후군(insulin resistance syndrome)’이라고 불릴 만큼 이전부터 인슐린 저항성과 관련이 있으며²⁾, 이는 지방 합성을 감소시켜 유리지방산을 증가시키고 결과적으로 심혈관 질환의 위험성에 기여한다¹⁾.

우리나라의 경우 질병관리청이 보고한 만성질환 유병률에 따르면 비만과 고콜레스테롤혈증 유병률은 꾸준하게 증가하고 있으며, 2020년 기준 19세 이상 국민의 비만 유병률의 증가폭은 4.2%, 고혈압은 0.4%, 당뇨병은 1.4%, 그리고 고콜레스테롤혈증은 1.7%인 것으로 나타났다³⁾. 현재 2006년 International Diabetes Federation에서 제창한 대사증후군 진단 기준에 따르면 다음 중심성 비만(한국인의 경우 남성 90 cm 이상, 여성 80 cm 이상)과 함께 중성지방이 150 mg/dL 이상, 고밀도지단백 콜레스테롤이 남성 40 mg/dL 미만, 여성 50 mg/dL 미만, 공복혈당이 100 mg/dL 이상 혹은 수축기 혈압이 130 mmHg 또는 이완기 혈압이 85 mmHg 이상인 경우 중 두 가지 이상 해당한다면 대사증후군으로 진단할 수 있다⁴⁾. 체질량지수(body mass index, BMI) 증가는 비만과 밀접한 관련성이 있으며, 비만은 담석증, 퇴행성 관절염, 불임, 수면무호흡증, 관상동맥질환 등 질환과 높은 상관관계가 있는 것으로 나타났다⁵⁾.

많은 요인들이 대사증후군 발생에 기여하며²⁾, 그중 영양소 섭취의 불균형은 중요한 요인 중 하나라고 할 수 있다. 특히, 고지방, 저섬유소의 음식을 지속적으로 섭취할 경우 장내미생물의 불균형(dysbiosis)이 발생하며, 이는 장내 치밀 결합(tight junction)을 느슨하게 만든다⁶⁾. 이러한 치밀 결합의 약화는 미생물이 만들어 내는 lipopolysaccharide, trimethylamine 등 대사산물들이 혈액 내로 들어가는 통로가 되어 간과 지방 조직의 염증 마커를 증가시키며, 결과적으로 심혈관계질환, 비만, 인슐린 저항성 등을 유발한다⁶⁾.

대사증후군 치료는 기본적으로 식사 치료, 운동 치료 및 행동 치료를 시행한다⁷⁾. 그러나 BMI 25 kg/m² 이상의 환자에서 위와 같은 보존적 요법에 실패할 경우 보조 요법으로 약물 치료를 시행할 수 있다⁷⁾. 그러나 기존 약물 치료 시 입마름, 불면, 어지러움, 심계항진, 두통 그리고 오심과 같은 위장관계 문제 등의 부작용이 확인되고 있어⁸⁾, 부작용이 적으면서 지속적으로 사용할 수 있는 한약 치료에 대한 연구가 활발하게 진행되고 있다^9,10).

그중에서도 백호가인삼탕(白虎加人參湯, Baekhogainsam-tang, Baihu Jia Renshen-tang, BIT)의 경우 동의보감에서 上消를 치료하며, 잘 먹으면서 갈증이 나는 경우에 사용한다고 하였다¹¹⁾. 여기서 消는 소갈, 즉 소모성 질환인 당뇨로 해석할 수 있으며, 예전부터 당뇨 치료에 BIT를 사용했음을 알 수 있다. 최근에는 BIT의 항당뇨 효과에 대한 체계적 문헌고찰 연구¹²⁾가 있으나 기재된 논문의 실험군 대부분을 혈당강하제와 병용한 군으로 설정하여 BIT 단독 투약에 대한 효과가 부족한 실정이다. 또한 국외에서 BIT에 대한 항당뇨¹³⁾ 및 항지질 효과¹⁴⁾가 활발하게 진행되고 있으나 국내에서는 대사 질환에 대한 BIT의 효과를 증명한 연구가 부족한 상태이다.

따라서 본 연구는 고지방식이 모델을 사용한 마우스를 대상으로 하여 정상(normal control, NC)군, 고지방식이(high-fat diet, HFD)군, 그리고 BIT군을 비교하여 대사 질환과 관련된 전반적인 마커의 변화를 확인하고 조직병리학적 분석을 진행하여 대사증후군에 대한 BIT의 효과를 확인하고자 한다. 또한, 장내미생물 및 유전자 분석을 통해 BIT군과 HFD군 간 장내미생물 변화와 발현되는 유전자에 차이가 나타나는지 확인하고자 한다.

1. 실험재료

실험에 사용한 약물은 일반의약품으로 시판되고 있는 한풍백호가인삼탕엑스과립((유) 한풍제약)을 사용하였다. BIT 1포는 감초(0.67 g), 갱미(3.33 g), 석고(5.33 g), 인삼(1.00 g), 지모(2.00 g)로 구성되어 있으며, 정제수에 녹여 경구 투여하였다. 성인 60 kg 기준으로 하루 4 g씩 3포, 총 12 g을 복용한다고 가정했을 때 이를 마우스 적용 환산인자로 계산하면 2,460 mg/kg이 되며, 실험동물들의 매주 측정한 체중에 맞춰 농도를 계산하여 경구 투여하였다.

2. 실험동물 및 투여방법

6주령 수컷 C57BI/6 Mouse (대한바이오링크)를 공급받아 2주 동안 실험 환경에 적응시켰으며, 각 군 간 몸무게 차이를 최소화하여 무작위로 NC군, HFD군, 그리고 BIT군에 각각 8마리씩 배정하였다. 실험동물의 순화를 위해 마우스를 cage에 넣고 온도 24±2 °C 및 습도 55±5%에서 명암주기를 12시간 간격으로 하여 specified pathogen-free 사육실에서 사육하였다. 모든 동물 실험은 동국대학교 일산병원의 연구동물윤리위원회의 지침에 따라 수행하였다(IACUC-2021-01211).

Pretreatment를 위해 모든 군은 공통적으로 chow diet (38057; Purina Korea Inc.)를 섭취하였으며, NC군과 HFD군은 정제수를, BIT군은 약물을 한 주에 6일간, 총 2주 동안 1회/1일 경구 투여하였다. 2주 후 본 실험에서 NC군은 10% kcal% fat diet를, HFD군은 45% kcal% fat diet와 함께 10% fructose water를, 그리고 BIT군은 HFD와 동일한 식이를 섭취하되 BIT (2,460 mg/kg)를 한 주에 6일간, 총 8주 동안 1회/1일 경구 투여하였다. 이때 NC군과 HFD군은 동일한 양의 정제수를 경구 투여하였다. 실험 종료 시에는 실험동물 희생을 위해 조레틸:럼푼=1:1 혼합액으로 마취한 후 심장에서 채혈을 하였고, 이후 각 조직을 채취하여 분석하였다.

3. 몸무게 및 섭취량 측정

실험동물 체중은 주 1회, 섭취량은 주 2회 측정하였다.

4. 경구 당부하 검사(oral glucose tolerance test, OGTT) 및 지방량 측정

혈당 측정을 위해 OGTT를 진행했으며, 실험 종료 1주 전 16시간의 공복상태를 유지하고 2 g/kg 농도의 포도당 수용액을 경구 투여 후 OGTT를 시행하였다. 0분, 30분, 60분, 90분 및 120분의 시간대에 각 실험동물의 꼬리정맥으로부터 혈액을 소량 채취하고 혈당검사기인 Accu-check (Roche Diagnostics)를 이용하여 혈당을 측정하였다. 결과 값은 area under the curve (AUC)를 다음 공식을 통해 계산하였다.

AUC (min⋅mg/dL)=30분 후 혈당×[1/2×(0분 후 혈당+120분 후 혈당)+1×(30분 후 혈당+60분 후 혈당+90분 후 혈당)]

실험동물 희생 후 간, 장간막 지방, 부고환 지방 및 피하지방 무게 측정을 위해 해당 조직을 적출하였다. 이후 phosphate buffered saline으로 세척 후 수분을 제거하여 무게를 측정하였다.

5. 혈청 생화학적 검사

실험동물의 혈액 채취를 위해 실험 종료 후 16시간 동안 절식시킨 마우스를 조레틸:럼푼=1:1 혼합액으로 마취한 후 심장 채혈을 통해 혈액을 얻었다. 채혈한 혈액은 상온에서 30분가량 방치한 후 3,000 rpm으로 30분 동안 원심분리하여 혈청(serum)을 얻었으며, 분석 전까지 -80 ℃에서 보관하였다. 혈액 내 triglyceride (TG), total cholesterol (TC) 및 high-density lipoprotein cholesterol (HDL)은 효소법을 이용한 정량측정 kit (Asan Pharmaceutical)를 사용하여 측정하였으며, insulin과 hemoglobin A1c (HbA1c)는 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 방법을 이용하여 측정하였다(insulin: Morinaga; HbA1c: Mybiosource). ELISA kit를 이용한 반응액의 발색 정도는 흡광도 450 nm에서 측정 후 표준곡선을 이용하여 각 농도를 정량화하였다.

6. 유전자 발현 분석(real-time polymerase chain reaction, RT-PCR)

실험동물 희생 후 필요한 조직을 수집하였으며, 간, 부고환 지방, 장 및 근육은 적출 후 액체질소로 동결하여 -80 °C에서 보관하였다. 각 조직을 균질화한 후, TRIzol reagent (Sigma-Aldrich)를 처리하여 total RNA를 분리하였다. 각 개체에서 1 µg의 RNA를 얻었으며, 이를 cDNA synthesis kit (RT PreMix kit; Bioneer)로 cDNA를 합성 후 template으로 사용하였다.

각 시료는 LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green (Roche)과 각 primer를 사용해 Light Cycler instrument로 진행하였다. PCR 증폭은 denaturation 95 °C 20초, annealing 57 °C 15초, 그리고 extension 72 °C 10초로 하여 40 cycle로 시행하였다. 실험 결과는 Light Cycler 480^TM device (Roche Applied Science)로 분석하였고 유전자의 발현량은 2^(-∆Ct)로 계산하였다. 모든 유전자 발현량은 glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase를 사용하여 정량화하였다.

7. 조직병리학적 분석

조직병리학적 분석을 위해 실험동물 희생 후 조직 샘플을 수집하였다. 내장지방량을 확인하기 위해 부고환 지방 조직을 채취하여 hematoxylin and eosin (H&E) staining을 시행하였으며, 간 조직의 지방량은 Oil red O (ORO) staining과 H&E staining을 시행하였다. 장 조직은 periodic acid-Schiff (PAS) staining을 시행하였다. ORO staining을 위해 간은 frozen section compound로 동결시킨 후 동결조직절편기를 이용하여 조직을 절편하여 슬라이드를 제작하였다. H&E staining과 PAS staining에 필요한 지방, 간 및 장 조직은 적출하여 4% 포르말린 용액에 고정시킨 후 파라핀으로 포매한 뒤 조직을 절편한 후 슬라이드를 제작하였다. 이렇게 제작된 슬라이드는 염색 kit에서 제공된 프로토콜에 따라 시행하였다.

8. 장내미생물 분석

실험동물을 희생하기 전에 분변 샘플을 채취하여 -80 °C에서 보관하였다. 이후 QIAamp stool DNA mini kit (QIAGEN)를 이용하여 각 분변 샘플로부터 metagenomics DNA를 추출하였고 16S rRNA gene의 과변부위 중 V1-2 region을 각 샘플의 multiplexing 판독을 위한 barcode sequence가 있는 범용 primer (8F와 338R)를 사용하여 PCR 과정이 수행되었다.

염기서열 분석은 Ion Torrent PGM system (Thermo Scientific)을 통해 진행하였고 얻어진 염기서열은 Quantitative Insights into Microbial Ecology 2 (QIIME 2) pipeline V2022.2로 전처리 과정을 거친 후 다양성 분석을 진행하였다¹⁵⁾. 서열 정보를 바탕으로 한 미생물의 분류는 Silva database를 참고하여 VSEARCH 프로그램을 이용하였다¹⁶⁾.

식이 및 약물 투약에 따른 각 군 내의 미생물 다양성 변화를 확인하기 위해 MicrobiomeAnalyst tool (https://www.microbiomeanalyst.ca)을 이용하여 데이터를 분석하였다¹⁷⁾. 풍부도가 낮은 미생물로 인한 오류를 최소화하기 위해 low count filter의 minimum count를 4로 설정하였고, prevalence는 20%로 설정하였다. Low variance filter는 사분범위(interquartile range)를 기본으로 하여 하위 10%는 제외하도록 설정하였다. 이후 total sum scailng 방식을 통해 데이터 정규화(normalization) 과정을 진행하였다.

α-diversity의 경우 genus level 수준에서 Shannon index와 Chao1 index를 사용하였고, 통계 처리는 analysis of variance (ANOVA) 분석으로 진행하였다. 각 군 간의 변화된 장내미생물을 비교하기 위해 β-diversity를 이용하였으며, genus level 수준에서 Bray-curtis index로 principal coordinate analysis (PCoA) 분석을 시행하였다. β-diversity 분석 시 통계 방법은 permutational multivariate analysis of variance (PERMANOVA)를 사용하였다. 다음으로 각 군에서 구체적인 장내미생물의 증감을 확인하기 위해 abundance profiling 분석을 시행했으며, 상대적 풍부도는 백분율로 표기하였다. 각 군내의 샘플들을 병합하여 데이터 처리를 하여 sequence reads가 genus level에 해당하지 않는 경우 “Not-Assigned”로 표기되었으며, sequence read count가 10 미만인 분류군의 경우 병합하였다. BIT군 및 HFD군은 8마리의 분변 샘플을 모두 분석하였으나 NC군의 경우 read count가 낮아 5마리의 분변 샘플만 이용하였다.

9. Microarray 분석

유전자 발현 분석을 위한 RNA 추출을 위해 간 조직을 용해시켰다. 총 RNA는 Trizol reagent (Invitrogen)의 프로토콜에 따라 분리되었으며, RNA 6000 Nano-chip을 사용한 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용하여 분리된 RNA quality를 분석하였다(Agilent Technologies). 또한 RNA quantification은 ND-2000 Spectrophotometer (Thermo Inc.)를 사용하였으며, 각 군의 총 RNA는 전사체 profiling에 사용되었다. Library는 Quant-Seq 3'mRNA-Seq library prep kit (Lexogen Inc.)의 프로토콜에 따라 수행하였다. 완료된 library를 PCR 구성에서 제거 후, high-throughput sequencing을 NextSeq 500 (Illumina)에 사용하여 수행하였으며, library layout은 Illumnia SE75가 사용되었다.

이바이오젠(ebiogen Inc.)에서 QuentSeq3'mRNA-Seq 전사체 분석을 수행하였다. Sequence 정렬은 Bowtie2¹⁸⁾를 이용하였고, 정렬된 파일은 전사 조립에 사용되어 유전자 풍부도 확인과 유전자 발현 차이를 감지할 수 있도록 하였다. 발현량에 차이가 있는 유전자들은 Bedtools¹⁹⁾의 범위를 이용하여 고유 및 다중 정렬의 수를 기반으로 결정되었다. Read count data는 Bioconductor²⁰⁾를 이용하여 R²¹⁾ 내의 EdgeR을 사용한 TMM+CPM normalization 방법을 기반으로 처리되었다.

유전자 발현의 패턴 분석을 위해서 ExDEGA software (Excel Based Differentially Expressed Gene Analysis; Ebiogen)를 사용하였다. 통계적으로 유의성 있게 발현된 유전자(differentially expressed gene) 선별은 p<0.05, fold change>2를 기준으로 시행하였다. 생물학적인 기능 분석을 위해 gene ontology법을 사용하였으며 이는 Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery Version 6.9 (DAVID; https://david.ncifcrf.gov/; accessed on May 28, 2021)를 사용하였다.

1. 몸무게 및 섭취량 변화

BIT의 체중감소 효과를 알아보기 위해 pretreatment 기간(2주)과 약물 투여 기간(8주) 동안 후 각 군의 섭취량 및 몸무게 변화를 측정하였다. 섭취량의 경우 HFD군보다 BIT군에서 약물 투여 6주차부터 증가하였으나 유의한 차이는 아니며(Fig. 1A), 약물 투여 8주차 몸무게의 경우 HFD군보다 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 감소하였다. BIT군에서 HFD군에 비해 사료 섭취량이 증가하였으나 체중은 매주 유의미하게 감소함으로써 BIT의 체중감소 효과를 확인하였다(Fig. 1B).

Fig. 1. The results of kcal intake, body weight, liver weight and fat mass. (A) The amount of kcal intake and its weekly changes among three groups in 2 weeks of pretreatment (p1, p2) and 8 weeks of treatment. (B) The body weight of three groups and its weekly changes were monitored during the same period. (C) The weight of liver weight and fat mass (total fat, subcutaneous fat, mesenteric fat and epididymal fat) of mice were measured. All data represents standard error of mean. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, p1: first week of pretreatment, p2: second week of pretreatment. ^##p<0.01, ^###p<0.001, ^####p<0.0001 (#: vs. NC). ^*p<0.05, ^**p<0.01 (*: vs. HFD).

2. 간 무게 및 지방량 측정

세 군의 실제 지방량 변화를 확인하기 위해 마우스를 희생하여 간 무게와 함께 전체 지방량(total fat weight)을 측정하였다. HFD군에서 간 무게는 NC군보다 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며 BIT군에서 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다. 전체 지방량은 HFD군보다 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 감소하였으며, 피하지방도 감소하였고, 내장지방에 해당하는 부고환 지방(epididymal fat)과 및 장간막(mesenteric fat) 지방의 무게도 유의성 있게 감소하여 BIT가 전반적인 체내 지방 감소에 효과적임을 보여주고 있다(Fig. 1C).

3. OGTT

BIT의 항당뇨 효과를 알아보기 위해 OGTT를 실험 종료 1주일 전 진행하였으며, 그 결과 HFD군의 OGTT AUC값은 NC군에 비해 통계적으로 유의하게 증가하였으나, BIT군의 OGTT AUC값은 HFD군과 비교했을 때 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2A).

Fig. 2. The effect of BIT on glucose and lipid level in serum. (A) The results of glucose AUC of glucose tolerance test among three groups 1 week before the end of the experiment. The changes of blood glucose level for 120 minutes were also monitored. From the blood sample of mice, (B) insulin, (C) HbA1c, (D) triglyceride, (E) total cholesterol, and (F) HDL cholesterol of three groups were measured after 8 weeks of treatment. All data represents standard error of mean. AUC: area under the curve, OGTT: oral glucose tolerance test, NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, HbA1c: hemoglobin A1c, HDL: high-density lipoprotein cholesterol. ^#p<0.05, ^##p<0.01, ^####p<0.0001 (#: vs. NC). ^**p<0.01, ^***p<0.001, ^****p<0.0001 (*: vs. HFD).

4. 혈청 생화학적 결과

실험 8주 후 희생된 쥐로부터 혈액을 원심분리하여 혈장을 채취하였으며, 항당뇨 효과를 확인하기 위해 insulin과 HbA1c를 측정하였다. 또한, 혈청 내 지질 농도를 확인하기 위해 TG, TC 및 HDL를 측정하였다.

혈중 insulin은 NC군보다 HFD군에서 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, 8주간 BIT를 복용한 군에서는 그 수치가 HFD군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2B). HbA1c의 경우 HFD군에서 NC군 대비 유의성 있게 증가했으나, BIT군에서 큰 변화는 나타나지 않았다(Fig. 2C).

TG 및 TC의 경우 약물 투여 8주 후 NC군보다 HFD군에서 유의성 있게 증가했으나, BIT군에서 HFD군보다 통계적으로 유의하게 감소하였다(Fig. 2D~E). 특히 TG 농도는 NC군보다 더 감소하였다. HDL의 변화는 HFD군에서 NC군보다 통계적으로 유의성 있게 감소하였으며, HFD군과 BIT군을 비교했을 때 BIT군에서 유의성 있게 증가하였다(Fig. 2F).

5. 간 조직의 quantitative polymerase chain reaction (qPCR) 검사 및 조직병리학적 분석 결과

본 연구에서는 간에서 당신생(gluconeogenesis)에 관여하는 phosphoenolpyruvate carboxykinase (PEPCK), glucose transporter type 2 (GLUT2), glucose-6-phosphatase (G6Pase) 유전자 발현 정도를 분석하였다. PEPCK의 경우 HFD군보다 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 감소하였으며, GLUT2는 유의성 있게 증가하였다. G6Pase는 HFD군에서 NC군보다 유의성 있게 증가하였으나 BIT군에서는 NC군만큼 감소하였다(Fig. 3A).

Fig. 3. The results of liver mRNA expression by quantitative polymerase chain reaction and histopathological findings of liver tissue in each group. (A) Genes analyzed from liver tissue are related to gluconeogenesis, lipogenesis, and inflammation. (B~D) Samples were done by hematoxylin and eosin staining and white circles manifest the lipid droplets (×200); These are (B) the result of NC group, (C) HFD group, and (D) BIT group. (E~G) Samples were done by Oil Red O staining and the red sites manifest the distribution of lipid (×400); These are (E) the result of NC group, (F) HFD group, and (G) BIT group. All data represents standard error of mean. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, PEPCK: phosphoenolpyruvate carboxykinase, GLUT2: glucose transporter type 2, G6Pase: glucose-6-phosphatase, LPL: lipoprotein lipase, PPAR-γ: peroxisome proliferator-activated receptor γ, ACC1: acetyl-CoA carboxylase 1, TNF-α: tumor necrosis factor-α, MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1. ^#p<0.05, ^##p<0.01 (#: vs. NC). ^*p<0.05, ^**p<0.01 (*: vs. HFD).

다음으로 지방 합성(lipogenesis)에 관여하는 lipoprotein lipase (LPL), peroxisome proliferator-activated receptor γ (PPAR-γ), acetyl-CoA carboxylase 1 (ACC1)의 유전자 발현 정도를 분석한 결과, HFD군보다 BIT군에서 발현 정도가 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 3A).

대사증후군은 체내 염증 반응 증가와 관련 있으며⁶⁾, 본 연구에서는 간 조직에서 염증 반응에 관여하는 tumor necrosis factor-α (TNF-α)와 monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)을 분석하여 HFD군보다 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 감소하였음을 확인하였다(Fig. 3A).

간 조직에서 지방 감소를 확인하기 위해 H&E staining (Fig. 3B~D)과 ORO staining (Fig. 3E~G)을 시행했다. 두 조직병리학적 검사에서 모두 HFD군에서 증가한 지방 방울의 면적이 BIT군에서 감소하였음을 확인하였다.

6. 근육 조직의 qPCR 검사

Glucose transporter type 4 (GLUT4)는 혈액 내의 포도당을 근육 내로 수송하여 근육의 당 대사를 돕는 포도당 수송체로 본 연구에서 HFD군은 GLUT4 유전자 발현이 감소하였으나 BIT군에서 증가했음을 확인하였다(Fig. 4).

Fig. 4. The results of skeletal muscle mRNA expression by quantitative polymerase chain reaction in each group related to glucose metabolism, fatty acid uptake, and mitochondrial biogenesis. All data represents standard error of mean. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, GLUT4: glucose transporter type 4, CPT-1α: carnitine palmitoyltransferase I, NRF1: nuclear respiratory factor 1, PGC1α: peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α. ^##p<0.01, ^###p<0.001, ^####p<0.0001 (#: vs. NC). ^*p<0.05, ^***p<0.001, ^****p<0.0001 (*: vs. HFD).

지방산 산화에 관여하는 carnitine palmitoyltransferase I (CPT-1α) 유전자의 발현은 HFD군 대비 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, NC군보다 높게 나타났다. 또한, 미토콘드리아 대사에 관여하는 nuclear respiratory factor 1 (NRF1) 및 peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator 1-α (PGC1α) 유전자 발현이 BIT군에서 HFD군보다 통계적으로 유의성 있게 증가하였다(Fig. 4). 이는 BIT가 mRNA 수준에서 대사작용 촉진을 유도할 수 있음을 보여준다.

7. 지방 조직의 qPCR 검사 및 조직병리학적 분석 결과

본 연구에서 마우스의 부고환 백색지방 조직을 채취하여 대표적인 adipokine인 adiponectin과 leptin이 실험 8주 후 각 군에서 어떻게 변했는지 확인했다(Fig. 5A). Adiponectin의 경우 HFD군과 비교했을 때 BIT군에서 통계적인 유의성은 없었으나 증가하는 경향을 보였다. Letpin의 경우 투약 8주 후 HFD군에서 NC군보다 유의하게 증가했으며 BIT군에서 유의성 있게 감소하였다.

Fig. 5. The results of epididymal white adipose tissue (eWAT) mRNA expression by quantitative polymerase chain reaction and histopathological findings of white adipose tissue in each group. (A) Genes are related to adipokine and lipogenesis. (B~D) Samples were done by hematoxylin and eosin staining (×200). (B) It represents the size of the adipocyte area in NC group, (C) represents HFD group, and (D) represents BIT group. (E) It is the statistical results comparing the size of the adipocyte area among three groups. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, LPL: lipoprotein lipase, PPAR-γ: peroxisome proliferator-activated receptor γ. ^#p<0.05, ^##p<0.01, ^###p<0.001, ^####p<0.0001 (#: vs. NC). ^*p<0.05, ^**p<0.01, ^****p<0.0001 (*: vs. HFD).

다음으로 지방 합성에 관여하는 LPL과 PPAR-γ를 분석한 결과, LPL은 HFD군보다 BIT군에서 통계적으로 유의성 있게 감소했으며, PPAR-γ는 통계적인 유의성은 없으나 BIT군에서 감소하는 경향을 보였다(Fig. 5A).

지방 조직의 지방 감소는 조직병리학적 검사에서도 확인할 수 있었으며, 이를 위해 부고환 지방에서 H&E staining을 진행했다. 지방 방울의 면적은 NC군에서 가장 작았으며(Fig. 5B), HFD군에서 가장 크게 나타났다(Fig. 5C). BIT군(Fig. 5D)에서는 HFD군보다 통계적으로 유의하게 지방 방울의 면적이 감소하였다(p<0.0001; Fig. 5E).

8. 장 조직의 qPCR 검사 및 조직병리학적 분석 결과

투약 8주 후 장내 치밀 결합의 결합력을 확인하기 위해 관련 유전자인 zonula occludens-1 (ZO-1), occludin 및 claudin-1을 분석하였다(Fig. 6A). HFD군은 NC군보다 통계적으로 유의하게 세 유전자들의 발현이 감소하였으나 BIT군에서 증가하였다. 특히, BIT군에서 ZO-1과 claudin-1 유전자 발현 정도가 NC군과 거의 유사한 수준으로 나타났다.

Fig. 6. The results of large intestine mRNA expression by quantitative polymerase chain reaction and histopathological findings of large intestine tissue in each group. (A) Genes are related to gut permeability and inflammation. (B~D) The large intestine tissue was stained with periodic acid-Schiff staining (×400). The villi of the intestine was stained purple; (B) It is the intestinal state of NC group, (C) HFD group, and (D) BIT group. All data represents standard error of mean. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang, ZO-1: zonula occludens-1, IL-1β: interleukin-1 beta, MCP-1: monocyte chemoattractant protein-1, TLR2: toll-like receptor 2. ^#p<0.05, ^##p<0.01, ^####p<0.0001 (#: vs. NC). ^**p<0.01, ^***p<0.001, ^****p<0.0001 (*: vs. HFD).

또한, 장내 염증 상태를 확인하기 위해 관련 mRNA 발현 정도를 분석한 결과 interleukin-1 beta (IL-1β), MCP-1, toll-like receptor 2 (TLR2)의 경우 HFD군에서 NC군보다 통계적으로 유의성 있게 증가하였다. BIT군은 세 가지 유전자에서 발현 정도가 HFD군에 비해 모두 감소하였으며, 특히 TLR2 발현은 통계적으로 유의성 있게 감소하였다(Fig. 6A).

BIT 투여가 장 구조 및 장벽 무결성의 손상을 개선시키는지 확인하기 위해 장 조직으로 PAS staining을 진행하였다. HFD군에서 술잔세포(goblet cell)의 수와 융모의 길이(보라색 영역)가 NC군 대비 감소하였으나 BIT군에서 NC군과 유사한 형태를 확인하였다(Fig. 6B~D).

9. 장내미생물 변화

본 연구에서는 고지방식이 섭취 상태에서 BIT 복용이 장내미생물 구성에 어떤 영향을 미치는지 확인하기 위해 각 군의 쥐의 분변 미생물을 분석하였다.

각 군 내의 미생물 다양성 정도를 알아보기 위해 α-diversity 분석을 진행하였으며, Shannon index와 Chao1 index를 사용하였다. 일반적으로 Shannon index는 미생물의 다양성을, Chao1 index는 미생물 풍부도를 확인하기 위해 사용한다. Shannon index의 경우 NC군에서 가장 높았으며 BIT군에서 다양성이 가장 낮게 나타났다(p<0.001). Chao1 index에도 마찬가지로 BIT군에서 풍부도가 가장 낮게 나타났으나 통계적인 유의성은 없었다(Fig. 7A, B).

Fig. 7. Diversity and abundance of gut microbiota in each group. (A) It was analyzed by Shannon index and (B) it was analyzed by Chao1 index for α-diversity. (C) The distances of each group were represented by β-diversity and it was performed by using principal coordinates analysis. (D) Altered community composition of gut microbiota and relative taxa abundance among three groups at the genus level. “Not_Assigned” stands for the sequence reads not included at genus level. The data for α-diversity presents mean±interquartile range. Relative abundance represents as percentage. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang.

각 군 간의 미생물 다양성 차이를 확인하기 위해 Bray-Curtis index를 이용하여 β-diversity를 분석하였으며, PCoA 방법을 사용하였다. PCoA상 세 군 모두 다른 벡터를 나타냈으며(Fig. 7C), HFD와 BIT가 대체로 구분되는 경향을 보여 BIT에 의해 장내미생물의 구성이 달라질 수 있음을 확인하였다(p=0.001).

다음은 구체적으로 각 군에서 어떤 미생물들이 차이가 나는지 확인하기 위해 genus level에서 abundance profiling을 생성하였다. BIT군에서는 NC군 및 HFD군보다 Bacteroides가 풍부했으며 HFD군에서는 다른 두 군보다 Alistipes가 증가하였다(Fig. 7D).

10. 유전자 발현 변화

본 연구는 BIT의 대사증후군에 대한 효과를 유전자 수준까지 보기 위해 쥐의 간 조직에서 추출한 mRNA를 microarray 분석 방법을 통해 각 군마다 유전자 발현의 증감 정도를 분석하였다.

실험 8주 후 HFD군과 BIT군에서 상향 및 하향 발현된 유전자를 알아보기 위해 scatter plot (Fig. 8A)과 heatmap (Fig. 8B)을 분석을 시행하였다. Scatter plot에서 붉은색 점에 해당하는 유전자가 HFD군보다 BIT군에서 발현이 증가한 것으로, Mup11, Serpina1e, Mup17, Cyp3a11 등이 확인되었다. 반대로 HFD군보다 BIT군에서 발현이 감소한 유전자는 Scd1, Apoa4, Lpin1, Cd36 등으로 확인되었다.

Fig. 8. Scatter plot and heatmap of altered gene expression. (A) Scatter plot represents comparison of gene expression between BIT group and HFD group. The red dots placed at upper side of red dotted line represent up-regulated gene in BIT group compared to HFD group. The green dots placed at lower side of green dotted line represent down-regulated gene in BIT group. (B) Heatmap shows the change of gene expression. Left side indicates increased/decreased gene at HFD group compared to NC group. Right side indicates increased/decreased gene at BIT group compared to HFD group. The color red represents up-regulated gene and the color purple represents down-regulated gene. NC: normal control, HFD: high-fat diet, BIT: Baekhogainsam-tang.

Heatmap에서 HFD군보다 BIT군에서 증가하거나 감소한 유전자는 NC군보다 HFD군에서 증감한 유전자와 대체로 반대의 결과가 나타났다. HFD보다 BIT에서 증가한 유전자 중에서 Scatter plot에서 공통적으로 나타난 유전자는 Mup11, Mup17, Cyp3a11 및 Gm15441이 있으며, 감소한 유전자는 Scd1와 Hectd2인 것으로 확인되었다. 특히, 발현이 증가한 유전자의 경우 대체로 비만한 마우스에서 감소하거나²²⁾ 대사증후군으로 인한 염증 반응을 일으키는 유전자 발현을 억제하며23), 포도당 대사 및 지질 대사 항상성을 유지하는 데 도움을 주는 것으로 알려져 있어²⁴⁾ BIT 투여로 인해 당신생과 지방 합성이 감소하여 대사증후군의 대사 조절에 관여할 수 있음을 보여주었다.

대사증후군을 일으키는 많은 요인들이 있으나 그중에서도 신체활동이나 과식 등 생활 습관과 환경이 가장 중요한 인자로 여겨지고 있다²⁾. 신체활동 감소와 고칼로리 음식 섭취의 증가는 내장지방이 증가하는 원인이 되고, 이는 여러 활성 산소와 염증 물질 증가로 이어져 결국 인슐린 저항성이 발생하는 결과를 초래한다²⁾. 식이는 장내미생물과 관련이 있으며 소화기관 안에는 Bacteroides, Bifidobacterium, Lactobacillus, Ruminococcus 등의 당화성 기능을 가진 genera들이 풍부하여 당을 분해하여 몸에 유익한 짧은사슬지방산(short chain fatty acid)을 생성하지만, 반대로 고지방식이를 과도하게 섭취할 경우 Firmicutes/Bacteroidetes 비율이 증가하는 것으로 알려져 있다²⁵⁾. 따라서 장내미생물이 체내 전반적으로 작용하여 대사에 직접적으로 관여한다는 보고가 지속적으로 나오고 있어^6,25) 본 연구는 이전부터 항당뇨제로 사용되었던 BIT를 고지방식이로 유도된 대사증후군 마우스 모델에 투약하여 전반적인 대사증후군 개선을 확인하고 이러한 효과가 장내미생물과 관련이 있는지 확인하고자 하였다.

본 연구에서 실험동물 체중은 주 1회 및 섭취량은 주 2회 측정하여 세 군의 식이 섭취량과 체중 변화를 확인하였으며, 섭취량은 HFD군보다 BIT군에서 미세하게 높았으나 체중은 BIT군이 HFD군보다 유의성 있게 낮았다. 또한 간, 내장지방 및 피하지방 무게를 측정했을 때도 BIT군에서 현저하게 낮아 BIT가 체지방량을 낮추어 체중을 감소시킬 수 있음을 확인하였다. 이외에도 혈청 내 지질 대사를 반영하는 TG 및 TC 농도가 감소하였고, HDL이 HFD군에 비해 BIT군에서 유의성 있게 증가하여 BIT가 지질 대사를 조절하는 데 효과적임을 알 수 있다. Yao 등¹³⁾ 연구에 따르면 당뇨 모델 마우스에 BIT 투여 시 인슐린 저항성이 감소한다는 보고가 있으며, 본 연구에서도 HFD군보다 BIT군에서 혈중 insulin 수치가 감소하여 BIT가 인슐린 저항성을 개선시킬 수 있음을 확인하였다. OGTT AUC 값도 HFD군에 비해 BIT군에서 감소하는 경향을 보였으나 통계적인 유의성은 없었다.

당 대사 측면에서 HFD군과 BIT군을 비교했을 때 간과 근육 조직의 당 대사 관련 유전자 발현에서 두 군 간 차이를 보였다. 간은 당신생이 발생하는 주요한 신체 기관이며 제2형 당뇨병 환자에서 간의 당신생 증가는 고혈당을 발생시키는 주요 기전 중 하나이다²⁶⁾. 본 연구에서는 간의 당 대사에 관여하는 유전자로 PEPCK, GLUT2 및 G6pase를 선정하여 분석하였다. PEPCK는 당신생 속도를 조절하는 역할을 하며, 단시간의 고혈당 노출은 PEPCK 유전자 발현을 감소시키나, 20시간 이상 만성적으로 고혈당에 노출될 경우 PEPCK 유전자 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다²⁷⁾. 본 연구에서도 HFD군에서 PEPCK 발현량이 높아지고, BIT군에서 감소하여 기존 연구와 일치하는 양상을 보였다. GLUT2는 혈액의 포도당을 간으로 수송해주는 역할을 하며 간으로 들어간 포도당이 글리코겐으로 합성되어 혈당이 조절된다²⁸⁾. 이와 반대로 G6Pase는 고혈당일 경우 간에서 유전자 발현이 증가하는 것으로 알려져 있다²⁹⁾. 본 연구에서는 BIT군에서 GLUT2가 통계적으로 유의성 있게 증가하였으며, G6Pase는 감소하는 경향을 확인하였다(p=0.05).

근육은 주요 에너지로 포도당을 이용하며, 포도당 수송체인 GLUT4가 발현되는 기관이다. 따라서 근육 내 GLUT4가 증가할수록 혈중 포도당 수치가 감소한다³⁰⁾. 본 연구에서도 HFD군에서 GLUT4 발현이 현저하게 감소하였으나 BIT군에서는 유의성 있게 증가한 것을 확인하였다.

본 연구에서는 BIT가 혈청 내 지질 수치를 감소할 뿐만 아니라 간, 근육 및 지방 조직에서 지질 대사를 조절한다는 것을 확인하였다. 간에서는 지방 합성에 관여하는 여러 유전자들이 발현되며, 대표적으로 LPL, PPAR-γ, ACC1 등이 있다. LPL의 경우 카일로마크론이나 very-low-density lipoprotein 등 TG가 풍부한 지단백 대사에 관여하며 체내 지방이 많은 경우 LPL 유전자의 발현이 증가한다³¹⁾. PPAR-γ는 대부분 지방 조직에 풍부하나 간에서도 소량 발현된다. 간에서 PPAR-γ가 과발현될 경우 fatty acid-binding protein 4 (FABP4), cluster of differentiation 36 (CD36), Perilipin 2 등 간으로의 지방 흡수, TG 저장 및 지방 방울 형성에 관여하는 단백질 분자들을 상향 조절하여 지방간을 유발한다³²⁾. ACC1은 백색지방과 같이 지방형성 조직의 주요 isofrom으로 간에서 포도당을 지방으로 합성하는 de novo lipogenesis의 주요 조절자이다³³⁾. 본 연구에서는 세 가지 유전자의 발현 정도를 비교했으며, BIT군과 HFD군 간 통계적인 유의성은 없었으나 대체로 BIT군에서 낮은 정도로 발현되어 BIT가 간의 지질 대사를 조절하는 데 도움을 줄 것으로 사료된다.

이와 대조적으로 근육에는 지방산 산화를 촉진하는 유전자가 발현되며, 대표적으로 CPT1이 있다. 근육에서는 주로 CPT-1β가 발현되지만 본 연구에서는 근육 조직에서 CPT-1α도 발견할 수 있었으며, 유전자 발현이 HFD군보다 BIT군에서 유의성 있게 증가하였다. CPT1은 미토콘드리아에 존재하는 막관통 효소(transmembrane enzyme)로 긴사슬지방산은 미토콘드리아 내에서 산화되는데, 이 과정이 감소하게 되면 지질 축적이 증가하고 인슐린 저항성을 가속화한다³⁴⁾. 그러나 현재 CPT-1α가 근육 내에 존재하는지에 대한 연구가 불충분하기 때문에 이와 관련된 추가적인 연구가 필요할 것으로 보인다. 이외에도 근육에는 NRF1이나 PCG1α 등 미토콘드리아 대사에 관여하는 유전자가 발현되는 곳으로, 미토콘드리아 내 생합성 과정에서 PCG1α는 NRF1 전사 활성을 조절하며, 이 단백질은 세포 호흡을 통해 발생하는 ATP 생산 능력을 향상시킨다³⁵⁾. 본 연구에서는 HFD군과 비교했을 때 BIT군에서 NRF1과 PCG1α의 유전자 발현 모두에서 통계적으로 유의성 있게 증가하여 BIT가 신체 대사 능력도 향상시킬 수 있음을 보여준다.

지방 조직은 지방을 저장하는 역할뿐만 아니라 내분비 기관의 기능도 담당하여 체내 대사와 관련된 여러 물질들이 합성 및 분비되는 곳이다³⁶⁾. 그중 지방 조직에서 분비되는 단백질 인자를 adipokine이라고 하며 전신의 대사 조절을 관장하고 있다³⁶⁾. Adipokine의 일종인 adiponectin은 근육 및 간에서 지방산 합성과 당신생을 억제하는 역할을 하여 지방 사용량을 증가시키는 것으로 알려져 있으며, letpin은 중추신경계를 통한 섭식 조절을 하며 지방량과 비례하여 그 수치가 증가한다³⁶⁾. 본 연구에서는 투약 8주 후 BIT군에서 adiponectin이 증가하고 leptin이 감소하여 기존 이론과 일치하는 결과를 도출했다.

지방 조직에서 지방 합성을 담당하는 대표적인 물질은 LPL과 PPAR-γ가 있으며 간 조직의 qPCR 결과와 마찬가지로 모두 BIT군에서 감소하여 BIT가 지방 조직의 지방 축적을 방지하는 기능이 있음을 확인하였다. 또한, BIT의 지방 감소 효과는 간 조직과 지방 조직의 조직병리학적 검사에서도 지방 방울이 차지하는 면적이 HFD군보다 BIT군에서 더 작아진 것을 통해 알 수 있다.

장벽(gut barrier)은 단층의 세포로 구성되어 있으며, 세포들은 치밀 결합에 의해 단단하게 결합되어 있다⁶⁾. 고지방식이로 유도된 마우스에서 이러한 치밀 결합 유전자가 감소하여 장 투과성이 증가된다는 보고가 있으며, 혈장으로 IL-1β, IL-6, interferon γ, TNF-α 등 여러 염증성 사이토카인이 분비되어 전신적인 염증 상태를 일으킨다³⁷⁾. 장벽의 치밀 결합에 관여하는 유전자는 대표적으로 ZO-1, occludin, claudin-1 등이 있으며³⁷⁾, 본 연구에서는 HFD만 먹은 군에서는 세 가지 유전자 발현이 감소했으나, BIT군은 occludin을 제외하고 NC군과 거의 유사한 정도로 증가하여 BIT가 장 환경의 항상성을 유지하는 데 도움을 줄 수 있다는 것을 확인하였다. 이는 조직병리학적 결과에서도 술잔세포의 수와 융모의 길이가 HFD군보다 BIT군에서 NC군과 유사한 형태를 확인할 수 있었다.

이외에도 HFD군의 장 조직과 간 조직에서 증가한 염증 물질(TNF-α, MCP-1, IL-1β, 및 TLR2)이 BIT군에서 감소하여 BIT가 대사증후군에서 나타나는 전신적인 염증 상태를 낮추는 효과가 있음을 확인하였다.

장은 세포들의 치밀 결합 외에도 장내미생물의 영향을 많이 받는 기관이다. 고칼로리 음식은 장내미생물 기능을 변화시키고 대사 기능 및 에너지 항상성에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 대사증후군 환자들은 정상군과 다른 장내미생물 패턴을 가지고 있다⁶⁾. 이러한 이론을 바탕으로 하여 본 연구에서는 BIT가 고지방식이로 유도된 장내미생물에 영향을 주는지 확인하기 위해 마우스의 분변을 채취하여 장내미생물 분석을 시행하였다. 본 연구에서는 장내미생물의 구성 변화를 확인하기 위해 α-diversity와 β-diversity를 분석하였다. BIT군은 다른 두 군에 비해 장내미생물 다양성과 풍부도가 낮았으나 β-diversity에서 세 군이 명확하게 구별되어 BIT가 장내미생물 구성에 영향을 미친다는 것을 알 수 있다. 본 연구는 genus level에서 장내미생물을 분석했으며, BIT군에서 다른 두 군에 비해 Bacteroides가 현저하게 증가하였다. Bacteroides는 비만 환자에서 정상인보다 감소되어 있으며, 갈색지방 조직이 비만 환자에게 증가한 branched-chain amino acids를 대사할 수 있도록 도와주는 역할을 한다³⁸⁾. 또한 건강한 장내 환경을 유지할 수 있도록 해주고, 죽상동맥경화증에 대한 보호 효과가 있다고 알려져 있다³⁸⁾. 비록 BIT군이 α-diversity에서 다양성과 풍부도가 낮게 측정되었으나 이는 Bacteroides가 증가하면서 나타나는 결과로 사료된다.

본 연구에서는 BIT가 실제 유전자 발현을 조절하여 대사증후군을 개선시키는지 확인하기 위해 microarray를 통한 유전자 발현 분석을 시행하였다. 구체적으로 증감된 유전자를 확인한 결과 HFD군보다 BIT군에서 Cyp3a11, Gm15441, Mup11, Mup17 등이 증가하였으며, Scd1, Hectd2 등이 감소하는 경향을 보였다. 발현이 증가한 유전자 중에서 CYP3a11의 경우 고지방식이를 먹인 마우스의 간에서 유전자 발현이 감소했다고 보고한 연구가 있었으며²²⁾, Gm15441의 경우 대사증후군으로 증가한 염증소체의 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다²³⁾. 또한, Mup11 및 Mup17 유전자는 포도당 항상성을 유지시키고 지질 대사에 관여하며 손상된 미토콘드리아 기능을 회복하여 에너지 소비를 증가시키는 역할을 한다²⁴⁾. 이와 반대로 stearoyl-CoA desaturase 1을 암호화하는 Scd1 유전자는 de novo lipogenesis에 관여하며, 이 유전자를 제거한 마우스는 고탄수화물 식이에 저항성을 갖는다고 하였다³⁹⁾. BIT군에서는 다른 두 군에 비해 Bacteroides가 증가하였으며, Yang 등⁴⁰⁾의 연구에서 Bacteroides acidifaciens의 비만 개선 효과와 Scd1 발현 간 상관관계를 분석하고자 하였으나 통계적인 유의성은 없었다.

본 연구는 기존에 밝혀진 BIT의 항당뇨에 대한 효과 외에도 대사증후군 전반에 걸쳐 항지질 및 항염증 효과가 있다는 것을 확인하였다. 또한 근육 내의 미토콘드리아를 활성화하여 대사 능력을 높이고 지방 산화를 촉진시킨다. 장에서는 장벽 기능을 강화하고 장내미생물 구성에 영향을 미치며 대사증후군을 개선시킬 수 있는 genus가 BIT군에서 증가했음을 확인하였다. 마지막으로 유전자 분석까지 시행하여 BIT군과 HFD군 간 유전자 발현의 차이를 확인하여 BIT가 유전자 수준까지 영향을 미칠 수 있으며, 추후 대사증후군을 개선시킬 수 있는 치료제로서 역할의 가능성을 제시하였다.

그러나 본 연구는 다음과 같은 한계점이 있다. 첫째, 대조군을 NC군과 HFD군으로만 설정하여 BIT가 실제 사용되는 약물과 비교했을 때 동등한 약리학적 효과가 있는지 알기 어렵다. 따라서 추후 연구에서는 metformin 등 기존 약물과 BIT 효과를 비교한 연구가 필요할 것으로 보인다. 둘째, 장내미생물을 genus level까지만 분석하여 추후에는 species level에서 변화하는 미생물을 상세하게 확인할 필요가 있다. 마지막으로 본 연구는 BIT의 효과를 알아보기 위해 유전자 수준까지 분석하였으나 장내미생물과 관련성을 연결하기에 부족하다. 따라서 유전자 발현과 미생물의 상관관계를 심도 있게 분석하는 연구가 필요할 것으로 보인다.

본 연구는 BIT가 체중과 지방을 감소시키며, 간, 근육, 지방 및 장 조직에서 대사증후군과 관련된 유전자 발현을 조절하여 당 대사, 지질 대사 및 미토콘드리아 대사를 개선하고 염증 물질을 감소시킨다는 것을 보여주었다. 또한 장의 치밀 결합에 관여하는 유전자 발현과 장내 유익균을 증가시키며 대사증후군을 개선시키는 유전자 발현을 상향 조절하여 BIT가 미생물과 유전자 수준까지 변화를 일으킬 수 있음을 확인하였다.