노화(aging)는 피할 수 없는 과정으로 다양한 수준에서 장기의 기능을 퇴화시켜 스트레스, 손상 및 질병에 저항할 수 있는 능력의 점진적인 쇠퇴를 초래한다¹⁾. 그 중 세포 노화(cellular senescence)는 노화의 주요 특징이며, 조직과 기관의 노화를 촉진하는 주요 원인이다²⁾. 노화는 자유라디칼이 형성되고 제거되는 균형이 무너져 과도하게 형성되는 것을 특징으로 하는 산화 스트레스가 발병기전의 요인 중 하나가 된다^3,4).

골격근은 체중의 약 40%를 차지하는 신체의 가장 큰 조직이며 운동, 체온조절, 신진대사와 같은 기능에 중요한 역할을 하는데^5,6), 골격근의 질량 및 기능의 손실은 노화의 중요한 징후이며, 노화는 골격근 위축에 기여하는 요인으로 작용하고, 연령이 증가함에 따라 발생하는 골격근 양 및 기능의 상실은 삶의 질을 저하시키며, 다양한 질환의 발병률 및 사망률의 증가와 관련성이 높다^6,7). 골격근의 노화 유도의 기본 기전에 대해서 완전히 밝혀지지 않았지만, 노화 유발의 인자로 산화적 스트레스, DNA 손상, 텔로미어 단축 및 염증 등이 포함된다^2,8).

D-galactose (D-gal)는 당단백질의 구성 요소로 유제품, 과일 및 채소 등 다양한 식품에 풍부하게 존재하는 환원당의 일종으로 정상적인 농도에서는 포도당으로 대사된다⁹⁾. 그러나 비정상적인 축적은 D-gal 산화효소의 작용을 통해 노화 촉진에 기여해^10-12), 최종 당산화물(advanced glycation end products, AGE) 생성을 증가시켜서 세포 노화를 모방하기 때문에 본 연구에서 노화의 유도를 위해 D-gal을 사용하였다^10,11).

물풀과(Lamiaceae family)에 속하는 한해살이 식물인 소엽(蘇葉, Perilla frutescens (L.) Britt.)은 전 세계적으로 널리 분포하며, 아시아 지역에서 오랫동안 다양한 질환의 예방과 치료의 목적으로 활용되어 왔다^13,14). 한의학에서 자소엽은 解表散寒, 行氣寬中, 理氣安胎 약으로 사용되며, 外感風寒의 輕症에 사용되나 行氣하는 작용도 있어 氣機를 通暢시키는 데에 사용하기도 한다¹⁵⁾. 특히 자소엽의 항산화 활성은 다양한 질환의 개시와 진행을 차단하는데 기여하는 것으로 보고된 바 있다. 예로, 최근 자소엽 추출물은 자유 라디칼 제거능이 매우 우수하며, 세포 내 활성 산소종(reactive oxygen species, ROS) 생성 억제를 통하여 항돌연변이 및 항염증 효능을 보임이 보고된 바 있다¹⁶⁾.

그러나 현재까지 자소엽의 골격근에서의 항산화 활성과 항산화 활성을 통한 골격근 노화에 미치는 영향에 대해서는 보고된 바가 없었다. 따라서 본 연구에서는 자소엽 추출물의 항노화 효능을 평가하기 위하여 D-gal에 의한 C2C12 근원세포(myoblasts) 모델을 확립하여 자소엽 에탄올 추출물(ethanol extract of Perilla frutescens leaf, EEPF)이 노화 연관 지표들의 변화에 미치는 영향을 조사하였다.

1. 세포배양 및 D-gal과 EEPF의 처리

본 연구에 사용한 C2C12 근원세포(mouse myogenic cell line)는 American Typical Culture Collection (Manassas, VA, USA)에서 구입하였으며, 10% (v/v) fetal bovine serum과 1% (v/v) penicillin/streptomycin이 함유된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; WelGENE Inc., Gyeongsan)을 이용하여 37 ℃ 및 5% CO₂ 조건의 배양기에서 배양하였다. D-gal은 Sigma-Aldrich (MO, USA)에서 구입하였으며, 세포에 처리하기 위하여 phosphate-buffered saline (PBS)에 적정 농도로 녹인 후 배지에 희석하였다. EEPF의 제조를 위한 건조된 자소엽은 ㈜대한생약제품(부산)에서 구입하였으며, 잘게 잘라 분쇄한 후 초고속 저온추출기(ultra-high-speed low-temperature extractor; Kyungseo E&P Co., Incheon)를 이용하여 50 ℃에서 4시간 동안 1:10 (v/v)의 비율로 60% 에탄올로 추출하였다(수율 23%). 추출물(EEPF)을 여과하여 용해되지 않은 잔류물을 제거하고 진공 회전 증발기(vacuum rotary evaporator; Tokyo Rikakikai Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여 농축한 다음 동결 건조기(freeze dryer; SP Industries Inc., PA, USA)를 사용하여 건조 후 4 ℃ 냉장고에 보관하였다. EEPF를 세포에 처리하기 위해서는 에탄올에 다시 적정 농도로 용해하여 0.22 ㎛ 여과막으로 여과한 후 배지에 적정 농도로 희석하였다.

2. 세포 생존율의 측정

D-gal 및 EEPF의 단독 처리 또는 1시간 동안 EEPF 전처리 후 D-gal이 24시간 처리된 C2C12 세포의 생존율을 대조군과 비교하기 위하여 cell counting kit-8 (CCK-8; Sigma-Aldrich)을 사용하였다. 이를 위하여 약물 처리 후, 제조사의 지침에 준하여 CCK-8 용액을 첨가하고 15분 동안 반응시킨 후 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 판독기(Dynatech Laboratories, VA, USA)를 사용하여 450 ㎚ 흡광도에서 광학 밀도(optical density)를 측정하였다. 처리되지 않은 대조군 세포의 광학 밀도를 100% 생존율을 나타내는 값으로 설정하였다.

3. 단백질 분리 및 western blot 분석

다양한 조건에서 배양된 C2C12 세포에서 세포 증식 및 세포 노화 마크와 염증성 인자 및 NF-κB 활성 관련 단백질들의 발현 변화를 조사하기 위하여 western blot 분석을 수행하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 모아 PBS로 수세 후, radioimmunoprecipitation assay lysis buffer (Sigma-Aldrich)를 사용하여 총 단백질을 추출하거나, Nuclear extract kit (Active Motif, Inc., CA, USA)를 이용하여 세포질과 핵의 단백질을 분리하였다. Pierce BCA Protein Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)를 사용하여 분리된 단백질을 정량화한 후, 각 처리군별로 동량의 단백질을 sodium-dodecyl sulfate-polyacrylamide gel을 이용한 전기영동으로 분리하고, polyvinylidene difluoride membrane (MA, USA)으로 전이시켰다. 단백질이 전이된 막을 4 ℃에서 검출 대상 1차 항체에 반응시키고, PBS로 세척 후, 1차 항체에 적절한 2차 항체(horseradish peroxidase-conjugated secondary antibodies; Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)에 반응시켰다. 이어서 enhanced chemiluminescence 용액(R&D Systems Inc., MN, USA)과 Fusion FX imaging system (Vilber Lourmat, Torcy, France)을 이용하여 해당 단백질의 발현 정도를 검출하였다. 본 연구에 사용된 1차 항체는 Santa Cruz Biotechnology Inc., Cell Signaling Technology Inc. (MA, USA) 및 Abcam Inc. (MA, USA)에서 구입하였다(Table I).

Table I

Antibodies Used for Western Blot Analysis in the Present Study

Antibody	Supplier	Item no.		Dilution
PCNA	Abcam Inc.		ab92552		1:1,000
p16	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-9968		1:1,000
p53	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-126		1:1,000
p21	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-397		1:1,000
IL-6	Cell Signaling Technology Inc.		#12153		1:1,000
IL-18	Cell Signaling Technology Inc.		#54943		1:1,000
NF-κB	Cell Signaling Technology Inc.		#8242		1:500
IκBα	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-371		1:1,000
Lamin B	Abcam Inc.		ab16048		1:1,000
β-actin	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-1615		1:2,000
Goat anti-rabbit IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-2005		1:1,500
Goat anti-rabbit IgG-HRP	Santa Cruz Biotechnology Inc.		sc-2004		1:1,500

PCNA: proliferating cell nuclear antigen, IL: interleukin, NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, IκBα: inhibitor of nuclear factor kappa B, Ig: immunoglobulin.

4. 유세포 분석에 의한 세포사멸 분석

D-gal 처리에 의한 C2C12 세포의 세포사멸 유도에 미치는 EEPF의 영향을 조사하기 위하여 annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC) apoptosis detection kit (R&D Systems Inc.)를 사용하였다. 이를 위하여 EEPF를 C2C12 세포에 1시간 처리 후, D-gal이 함유된 배지에서 24시간 동안 배양하였다. 이어서 제조사 지침에 따라 수집된 세포를 PBS로 세척하고 고정시킨 후, 20분 동안 annexin V-FITC/propidium iodide로 염색하였으며, 유세포 분석기(flow cytometer; Becton Dickinson, CA, USA)를 이용하여 annexin V 형광을 띄는 세포(annexin V-positive cells)를 세포사멸이 유도된 집단의 빈도로 간주하였다.

5. 핵 염색을 통한 세포사멸의 분석

D-gal을 EEPF가 있거나 없는 조건에서 배양된 세포의 핵의 형태학적 변형에 기초한 세포사멸 유발 정도를 비교하기 위해서는 4,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 염색법을 적용하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 PBS로 세척한 후 PBS에 녹인 3.7% paraformaldehyde (Sigma-Aldrich)로 실온에서 10분 동안 고정하였다. 이어서, 세포를 다시 PBS로 세척하고, 2.5 μg/ml의 DAPI (Sigma-Aldrich)용액으로 10분 동안 염색한 후, 형광 현미경(fluorescence microscope; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany) 하에서 핵의 형태적 변화를 관찰하였다.

6. 항산화 활성의 분석

EEPF 처리 1시간 후, D-gal이 24시간 처리된 C2C12 세포에서 EEPF의 항산화 활성을 조사하기 위하여 catalase (CAT; Sigma-Aldrich), glutathione peroxidase (GSH-Px; Abcam Inc.), total antioxidant capacity (T-AOC; Sigma-Aldrich), superoxide dismutase (SOD; Abcam Inc.) 및 malondialdehyde (MDA; Sigma-Aldrich) 분석 kit를 사용하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 모아 초음파 처리로 파괴한 후 상층액을 모으고, 각 kit 제조업체의 지침에 따라 3회 반복 해당 항목의 활성을 측정하였다.

7. ROS 생성의 측정

C2C12 세포에서 D-gal에 의한 ROS의 생성에 미치는 EEPF의 영향을 조사하기 위하여 EEPF를 1시간 전처리 후, D-gal을 1시간 동안 처리하였다. 처리 후, 세포를 PBS로 세척하고 1% Triton X-100 (PBS-T)이 포함된 PBS로 37 ℃에서 10분 동안 용해시켰다. 세포를 암실에서 30분 동안 10 μM의 2',7'-dichlorofluorescein diacetate (DCF-DA; Molecular Probes, Leiden, Netherlands)로 염색하고 유세포 분석기를 이용하여 ROS의 생성 정도를 제조사의 지침에 따라 측정하였다.

8. 미토콘드리아 막 전위의 분석

EEPF가 포함된 배지에서 1시간 동안 배양한 다음, D-gal이 24시간 처리된 C2C12 세포의 미토콘드리아 활성 분석은 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1'3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanune iodide (JC-1)을 사용한 미토콘드리아 막 전위(mitochondrial membrane potential, MMP, Δψm) 변화를 측정하였다. 이를 위하여 처리가 끝난 세포를 모아 PBS로 세척하고 10 μM의 JC-1 (Sigma-Aldrich)을 첨가하여 37 ℃에서 20분 동안 반응시켰다. 이어서 세포를 PBS로 다시 세척하고 유세포 분석기를 사용하여 MMP를 평가하였다.

9. β-galactosidase (β-gal) 활성의 분석

D-gal 유도 C2C12 세포의 세포 노화에 미치는 EEPF의 영향을 조사하기 위하여 EEPF가 포함된 배지에서 1시간 동안 배양한 다음, D-gal을 24시간 처리하였다. 처리 후, senescence-associated (SA)-β-Gal kit (Cell Signaling Technology Inc.)를 이용한 β-gal의 활성을 측정하기 위하여 kit에서 제공된 SA-β-Gal 염색 용액 고정제(SA-β-Gal staining solution fixative)를 세포에 첨가하였다. 실온에서 15분 동안 고정시킨 후, PBS로 3분 동안 3회 세척하였다. 이어서 SA-β-Gal 염색 용액(SA-β-Gal staining working solution)을 첨가하여 12시간 반응시킨 후 세포를 위상차 현미경(phase-contrast microscope, Carl Zeiss)으로 β-gal의 염색 정도를 관찰하고 그들의 활성을 측정하였다.

10. DNA 손상의 분석

EEPF가 D-gal 처리에 의한 C2C12 세포의 DNA 손상에 어떠한 영향을 미치는지를 조사하기 위하여 DNA 손상 마크인 phosphorylated-H2A histone family member X (γ-H2AX, Ser139)의 발현 변화를 조사하였다. 이를 위하여 EEPF를 1시간 동안 전처리하고 D-gal을 24시간 동안 처리한 C2C12 세포를 100% 메탄올로 -20 ℃에서 10분 동안 고정시키고 PBS로 3번 세척하였다. 고정된 세포를 5% bovine serum albumin (BSA; Sigma-Aldrich)가 함유된 PBS-T에 1시간 상온에서 반응시키고 2.5% BSA로 희석한 γ-H2AX 항체(Santa Cruz Biotechnology Inc.)를 첨가하여 4 ℃에서 12시간 동안 반응시킨 후 PBS-T로 10분간 2회 세척하였다. 이어서 상온에서 1% BSA로 희석한 2차 항체(Alexa Fluor 488-labeled donkey anti-rabbit IgG, Thermo Fisher Scientific)를 첨가하여 1시간 동안 반응시켰다. PBS-T로 2회 10분간 세척한 후 암실에서 20분 동안 DAPI 용액을 이용하여 핵을 추가로 염색시키고 PBS-T로 수세 후 형광현미경 하에서 γ-H2AX의 발현 강도를 관찰하였다.

11. 염증성 cytokine 생성의 분석

D-gal에 의한 C2C12 세포의 염증성 반응과 이에 미치는 EEPF의 영향을 조사하기 위하여 대표적인 염증성 cytokine인 interleukin (IL)-6 및 IL-18의 생성 수준을 Quantikine ELISA kit (R&D systems)을 이용하여 조사하였다. 이를 위하여 EEPF가 함유되어 있거나 없는 조건에서 1시간 배양된 세포에 D-gal을 24시간 처리한 후, 제조사의 지침에 따라 세포배양 상등액을 이용하여 IL-6 및 IL-18의 수준을 정량화하였다.

12. 면역 염색에 의한 NF-κB 발현의 분석

C2C12 세포에서 D-gal에 의한 NF-κB의 핵으로의 전이에 미치는 EEPF의 영향을 조사하기 위하여 EEPF를 1시간 전처리 후 D-gal을 추가로 1시간 처리하였다. 이어서 상온에서 3.7% paraformaldehyde로 10분간 고정 후, PBS-T로 수세하고, 2.5% BSA로 희석한 phosphorylated (p)-NF-κB 항체(Ser 536, Cell Signaling Technology Inc.)에 4 ℃에서 12시간 반응시키고 PBS-T로 세척하였다. 이어서, 2차 항체로 1시간 반응시키고, DAPI 용액으로 핵을 염색하였으며 다시 PBS-T로 세포를 세척한 후 형광현미경을 이용하여 p-NF-κB의 강도 및 세포 내 발현 위치를 분석하였다.

13. Statistical analyses

실험 결과의 통계 분석은 GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., CA, USA)으로 수행한 후 Tukey 사후 테스트로 수행하였다. 모든 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 평균±표준편차(standard deviation)로 제시하였고, p<0.05의 값을 유의미한 차이를 나타내는 것으로 간주하였다.

1. D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포 생존율 억제에 미치는 EEPF의 영향

D-gal의 처리 농도 증가에 따라 C2C12 세포의 세포 생존율이 점진적으로 억제되었다(Fig. 1A). 반면에 EEPF는 조사된 처리 농도 범위(0~250 ㎍/㎖) 내에서 유의적인 세포 생존율의 억제가 관찰되지 않았다(Fig. 1B). 또한, EEPF가 존재하는 조건에서 D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포 생존율 억제 효과는 처리 농도 의존적으로 감소하였다(Fig. 1C). 200 mM의 D-gal이 단독으로 처리된 C2C12 세포에서 proliferating cell nuclear antigen (PCNA)의 발현은 처리되지 않은 대조군에 비하여 현저하게 억제되었지만, EEPF가 존재하는 조건에서 PCNA의 발현은 대조군 수준으로 유지되었다. 아울러 200 ㎍/㎖의 EEPF가 단독으로 처리된 조건에서도 대조군과 유사한 수준으로 PCNA의 발현이 유지되었다(Fig. 1D).

Fig. 1. Inhibitory effects of EEPF on D-gal-induced reduction of cell viability and PCNA expression in C2C12 cells. Cells were treated with various concentrations of D-gal for 24 h. (A) or treated with EEPF for 1 h, and then stimulated with D-gal for 24 h (B-D). (A-C) The results of quantitative analysis of cell viability according to the CCK-8 assay were presented. The data were represented as mean±SD of three independent experiments. (D) After collecting cells and isolating total protein, changes in PCNA expression were detected using Western blot analysis. β-actin was used as a loading control. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, PNCA: proliferating cell nuclear antigen, CCK-8: cell counting kit 8, SD: standard deviation. Significant differences compared with the control cells (*p<0.05 and ^†p<0.001) or D-gal-treated cells (^‡p<0.05 and ^§p<0.001) were shown.

2. D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포사멸 유도에 미치는 EEPF의 영향

Fig. 2A의 우측의 하단과 상단에 제시한 숫자는 각각 초기 및 후기 세포사멸(early and late apoptosis)이 유도된 세포의 빈도를 의미한다(Fig. 2A). 또한 두 집단의 빈도를 세포사멸이 유도된 세포의 빈도로 제시하였다(Fig. 2B). D-gal이 단독으로 처리된 세포에서 세포사멸의 유도(17.0%)가 대조군(3.5%)에 비하여 약 5배 이상 증가하였다. 그러나 EEPF가 존재하는 조건에서 D-gal을 처리하였을 경우, 세포사멸 유도의 빈도가 억제되었으며(4.7%), EEPF 단독 처리군은 대조군 수준과 유사하였다(3.3%). 또한 D-gal이 단독 처리된 C2C12 세포에서 전형적인 세포사멸이 유도된 세포에서 관찰되는 염색질의 응축과 핵의 단편화 현상이 증가하였지만, EEPF의 전처리는 이를 유의적으로 감소시켰다(Fig. 2C, D).

Fig. 2. Inhibition of D-gal-induced apoptosis by EEPF in C2C12 cells. (A and B) Cells were fixed, stained with annexin V/PI, and then analyzed by flow cytometry. (A) The percentages of apoptotic cells were determined by counting the percentage of annexin V+ cells. (B) The results of flow cytometry analysis were expressed as the mean±SD. (C and D) After staining with DAPI, the morphology of the nucleus was observed. Representative photomicrographs of nuclei after DAPI staining (C) and quantified results (D) were shown. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, Annexin V/PI: Annexin V-Propidium iodide, DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindol. Significant differences compared with the control cells (*p<0.001) or D-gal-treated cells (^†p<0.001) were shown.

3. D-gal에 의한 C2C12 세포의 항산화 효소 활성 변화에 미치는 EEPF의 영향

D-gal 처리는 대조군과 비교하여 C2C12 세포에서 CAT, GSH-Px, T-AOC 및 SOD의 수준을 유의하게 감소시켰다. 그러나 EEPF 단독 처리군에서는 유의적인 변화가 없었으며, D-gal 처리군과 비교하여 EEPF 전처리는 이들의 수준을 유의하게 증가시켰다(Fig. 3A-D). D-gal 및 EEPF 처리가 C2C12 세포의 MDA 수준에는 영향을 미치지 않았다(Fig. 3E).

Fig. 3. Improvement of redox homeostasis by EEPF in D-gal-exposed C2C12 cells. (A) The levels of CAT, (B) GSH-Px, (C) T-AOC activity, (D) SOD activity and MDA activity were measured using commercially available kits according to their manufacturer's instructions. All data were expressed as the mean±SD. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, CAT: catalase, GSH-Px: glutathione peroxidase, T-AOC: total antioxidant capacity, SOD: superoxide dismutase, MDA: malondialdehyde. *p<0.001 compared with the control group, ^†p<0.05 and ^‡p<0.001 compared with the D-gal-treated group.

4. D-gal에 의한 C2C12 세포의 ROS 생성 및 미토콘드리아 기능 손상에 미치는 EEPF의 영향

D-gal이 단독 처리된 세포에서 ROS의 생성이 대조군에 비하여 20배 이상 증가된 반면, EEPF 단독 처리군에서는 대조군 수준으로 유지되었다. 그러나 EEPF가 존재하는 조건에서 D-gal에 의한 ROS의 생성은 60% 정도 억제되었다(Fig. 4A). D-gal이 함유된 배지에서 24시간 배양된 C2C12 세포에서 MMP의 소실은 대조군에 비하여 6배 정도 증가하였다. 그러나 EEPF가 존재하는 경우, MMP는 대조군 수준으로 유지되어 D-gal에 의한 미토콘드리아의 기능 소실이 온전하게 유지되었다(Fig. 4B).

Fig. 4. Protection of D-gal-induced ROS generation and mitochondrial dysfunction by EEPF in C2C12 cells. (A) or 24 h (B) with or without D-gal (200 mM). After collecting cells and staining with (A) DCF-DA or (B) JC-1, the levels of ROS generation and JC-1 monomers were determined using a flow cytometer. Percentages of (A) DCF-positive cells and (B) cells with JC-1 monomers were displayed as bars and the results were expressed as the mean±SD. ROS: reactive oxygen species, EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, DCF-DA: 2',7'-dichlorofluorescein diacetate, JC-1: 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1'3,3'-tetraethyl-imidacarbocyanune iodide. *p<0.001 compared with the control group, ^†p<0.001 compared with the D-gal-treated group.

5. D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포 노화 및 DNA 손상에 미치는 EEPF의 영향

SA-β-Gal 양성 세포의 수가 D-gal 처리군에서 현저하게 증가하였고, β-gal의 활성 또한 매우 증가하였다(Fig. 5A, B). 그러나 EEPF가 존재하는 조건에서는 D-gal 처리에 의한 C2C12 세포의 세포 노화를 유의하게 개선하였다. 또한 D-gal이 처리된 C2C12 세포의 핵에서 γ-H2AX의 발현이 매우 증가되었으며, EEPF의 전처리군에서는 γ-H2AX 양성 핵의 빈도뿐만 아니라 형광 강도 또한 현저하게 억제되었다(Fig. 5C).

Fig. 5. Attenuation of D-gal-induced cellular senescence and DNA damage by EEPF in C2C12 cells. (A and B) SA-β-gal staining was performed using the SA-β-gal kit according to the manufacturer's protocol to confirm cellular senescence. Representative cell images (A) of SA-β-gal staining and their activity (B) were presented. (C) After treatment, cells were double-stained with γH2AX (red) and DAPI (blue), and representative immunofluorescence images observed were shown. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, SA-β-gal: senescence-associated beta-galactosidase, DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindol. *p<0.001 compared with the control group, ^†p<0.001 compared with the D-gal-treated group.

6. D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포 노화 마크 및 염증성 반응 변화에 미치는 EEPF의 영향

p16, p53, p21 단백질의 발현이 대조군에 비하여 모두 증가하였지만, EEPF가 존재하는 조건에서 이들의 발현은 모두 감소되었다(Fig. 6A). Fig. 6B, C의 ELISA 결과에 의하면, 두 cytokine의 수준이 D-gal 단독 처리군에서 현저하게 증가하였지만, EEPF가 존재하는 조건에서는 유의적으로 감소되었다. 이러한 cytokine의 생성 변화가 그들의 단백질 발현의 변화에 따른 것인지를 조사한 결과, D-gal은 IL-6과 IL-18의 단백질 발현을 증가시킨 반면, EEPF의 전처리는 이들의 발현을 현저하게 차단하였다(Fig. 6A).

Fig. 6. Suppression of D-gal-induced senescence markers and inflammatory response by EEPF in C2C12 cells. (A) The levels of the indicated proteins were detected using western blot analysis. The production amounts of (B) IL-6 and (C) IL-18 using the cell culture supernatants were detected using corresponding cytokine detection kits according to their manufacturer's instructions. All data were expressed as the mean±SD. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, IL: Interleukin. *p<0.001 compared with the control group, ^†p<0.001 compared with the D-gal-treated group.

7. D-gal에 의한 C2C12 세포의 NF-κB 신호계 활성에 미치는 EEPF의 영향

D-gal이 단독 처리된 세포의 핵에서 NF-κB의 발현이 증가된 반면, 세포질에서 NF-κB의 발현은 감소되었다. 또한, IκBα의 발현이 감소되어 NF-κB가 D-gal의 자극에 의하여 세포질에서 핵으로 이동되었지만 EEPF가 존재하는 조건에서 핵으로의 NF-κB 이동은 차단되었다(Fig. 7A). 면역 형광 분석의 결과에 의하면, 인산화된 NF-κB의 발현(p-NF-κB)이 D-gal이 단독 처리된 세포의 핵에서 강하게 발현되었으며, 이 또한 EEPF에 의하여 현저히 억제되었다(Fig. 7B).

Fig. 7. Inactivation of NF-κB by EEPF in D-gal-treated C2C12 cells. (A) The expression of NF-κB and IκBα in nuclear and cytoplasmic fractions was investigated using Western blot analysis. Lamin B and β-actin were used as reference genes for each fraction. (B) After treatment, cells were double-stained with p-NF-κB (green) and DAPI (blue), and representative immunofluorescence images observed were shown. NF-κB: nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells, EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf, IκBα: inhibitor of nuclear factor kappa B, DAP: 4',6-diamidino-2-phenylindole.

세포 노화는 일반적으로 세포 주기를 벗어난 손상된 정상 세포가 비가역적으로 증식을 중단하는 것으로¹⁷⁾, 세포노화의 특징에는 연장되는 세포주기의 정지, 전사 변화, 노화 관련 분비표현형(senescence-associated secretory phenotype, SASP)로 알려진 생리활성분비물의 획득, 거대분자의 손상, 조절되지 않는 대사 등이 있다¹⁸⁾. 노화는 다른 많은 내인성 및 외인성 요인 중 특히 복제 스트레스(replicative stress), 산화적 손상(oxidative damage), 대사기능장애, 사이토카인 등에 의해 촉발될 수 있는데, 이러한 요인들은 정상세포에서 DNA 손상과 노화를 유발할 수 있다¹⁹⁾.

골격근은 다른 기관에 비하여 열 생성 및 전반적인 에너지 항상성에 중요한 역할을 하는 미토콘드리아가 풍부한 대사기관이다^2,20). 최근 연구 결과들에 의하면, 미토콘드리아 기능 장애가 골격근 노화의 병인에 중요한 역할을 할 수 있음을 알 수 있고, 노화 세포의 항상성 소실이 미토콘드리아 전자 전달 사슬의 기능을 교란시켜 활성 산소종(ROS)과 같은 자유 라디칼(free radicals)의 과도한 생성을 초래한다^2,8). 소거능을 초과한 과도한 ROS의 축적은 미토콘드리아와 핵 DNA를 손상시키고, 염증 반응의 증가와 텔로미어 단축 속도의 가속화 및 세포사멸(apoptosis)을 증가시켜 노화를 촉진시킨다^1,21).

결합 조직에서 발견되는 AGE는 다양한 질병뿐만 아니라 노화에 따라 축적되어 골격근 기능 장애의 지표로 인식되고 있는데^22,23), AGE는 자유 라디칼 및 염증성 cytokine의 생성을 촉진하여 근육 조직의 단백질 및 지방 성분을 손상시킨다^11,24). D-gal의 비정상적인 축적은 AGE 생성을 증가시킨다²⁵⁾. 증가된 AGE는 노화 촉진에 기여하기 때문에, D-gal은 산화적 스트레스 매개 노화 연구를 위한 모델로 널리 사용되고 있다^10-12). 이를 바탕으로 AGE 생성을 증가시켜 세포 노화를 모방하는 D-gal을 사용하였고^10,11), D-gal에 의한 C2C12 세포의 세포 생존율 억제, 세포사멸 유도, 산화적 스트레스 유도, 미토콘드리아 기능 손상 및 SASP 단백질 발현과 cytokine의 생성에 미치는 EEPF의 영향을 평가하였다.

자소엽(紫蘇葉)은 한의학에서 風寒感冒, 脾胃氣滯, 魚蟹中毒에 사용된다. 성질이 辛溫하고 芳香性이 있고, 脾, 肺經에 작용해 風寒邪氣를 發散시키고, 行氣작용이 있어 氣機를 通暢시키는 데에도 쓰인다^15,26). 최근 수행된 연구에 의하면 자소엽에는 다양한 플라보노이드, 카로티노이드와 휘발성 오일, 트리테르페노이드, 페놀 및 불포화 지방 등을 함유하고 있는 것으로 보고되었다^27,28). 이러한 성분들은 항염증, 항알레르기, 항우울. 면역 증강, 진정 작용 및 항암 활성과 같은 다양한 약리학적 특성에 기여하는 것으로 추정된다^13,29,30). 또한, 자소엽의 핵산 추출물(Perilla leaf hexane fraction, PLH)이 파골세포 분화를 억제하였지만, 조골세포의 기능은 촉진하였으며, 이는 ROS의 생산 차단과 밀접한 연관성이 있다고 보고된 바가 있다³⁰⁾. 이러한 PLH의 항산화 활성이 만성폐쇄성폐질환, 기도 염증 및 ovalbumin 유도 천식 기도 염증의 개선에도 관여하였다는 보고도 있었다^31,32). 아울러 자소엽 에탄올 추출물의 ROS 생성 억제 효능은 자외선에 의한 인간 진피 섬유아세포의 광 노화 차단에 기여하여 자소엽 추출물이 노화 방지를 위한 잠재적인 후보물질로 제안되기도 하였다³³⁾.

자소엽의 항산화 및 항염증 등의 작용에 대한 연구와 자소엽의 근육에 대한 영향에 대해서는 여러 연구가 진행되었으나, 자소엽의 항산화 작용이 근육의 노화에 미치는 영향에 대해서는 보고된 바가 없어 본 연구에서는 자소엽의 에탄올 추출물이 근육의 노화에 미치는 영향을 알아보기 위해 연구를 진행하였다.

본 연구에서는 먼저 C2C12 세포의 증식에 미치는 D-gal의 영향을 조사하였다. C2C12 세포에서 세포 독성 유발을 위한 D-gal의 처리 농도는 대조군 대비 약 70% 정도의 세포 생존율을 보인 200 mM로 설정하였다. D-gal에 의한 세포 생존율 억제를 EEPF가 억제할 수 있는지를 조사하기 위하여 다양한 농도의 EEPF가 함유된 배지에서 1시간 동안 배양 후, 200 mM의 D-gal을 24시간 동안 처리하였으며, 특히 200 μg/㎖의 EEPF 전처리군에서 250 μg/㎖ 전처리군에 비하여 세포 생존율 억제에 대한 보호 효과가 우수하게 나타났기 때문에 향후 실험에서 EEPF의 전처리 농도를 200 μg/㎖로 설정하였다. 이후 세포 증식 표지 인자로 가장 널리 사용되는 PCNA의 발현^34,35)에 미치는 D-gal의 영향을 조사하였다. 이를 위하여 western blot 분석으로 PCNA의 발현 변화를 조사하였다. 그 결과 EEPF가 D-gal에 의한 세포 독성을 유의적으로 차단하였으며, D-gal이 존재하는 조건에서도 C2C12 세포의 세포 분열과정 및 증식이 정상적으로 유지되고 있음을 알 수 있었다. PCNA의 발현은 세포의 증식 상태와 직접 연관되어 휴지기 세포에는 매우 적은 양이 존재하나 증식하는 세포에서는 증가하는 양상을 보인다³⁶⁾. 따라서 C2C12 세포에서 D-gal 처리에 의한 PCNA 발현 감소는 D-gal에 의하여 세포의 증식이 억제되었다는 것을 의미하며, 이를 EEPF가 차단하여 세포 주기의 지속적 진행과 세포 생존이 유지되었음을 나타내는 결과이다. 또한 D-gal은 산화적 스트레스, 미토콘드리아 기능 장애, DNA 손상 및 염증 반응을 증가시키면서 궁극적으로 세포사멸을 유도하는 것으로 알려져 있다^36,37). 본 연구 결과 EEPF가 D-gal 유도 세포사멸을 유의적으로 차단하였음을 제시하였다. 다음으로 EEPF에 의한 D-gal 유도 C2C12 세포의 세포사멸 억제 효능을 재검증하기 위하여 핵의 형태적 변형을 조사하였다. 그 결과 EEPF가 C2C12 세포에서 D-gal에 의한 세포사멸을 차단함으로써 세포 생존율의 억제를 유의적으로 회복시켰음을 알 수 있었다. 선행 연구에 의하면, 산화적 스트레스가 골격근에서 단백질 합성과 분해를 조절하는 신호 전달 경로에서 중요한 역할을 하며 산화환원 시스템의 교란은 골격근 세포의 위축과 사멸의 개시에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다^38,39).

CAT, GSH-Px, SOD, MDA는 과도한 ROS의 생성을 차단하고 산화 스트레스로부터 세포를 보호하도록 도울 수 있다⁴⁰⁾. 본 연구의 실험 결과, 선행 연구들의 결과와 일치되게 C2C12 세포에서 D-gal은 MDA에는 유의적인 영향을 주지 않았으나⁴¹⁾, CAT, GSH-Px, T-AOC 및 SOD의 활성은 D-gal 처리에 의하여 모두 억제되었으며, EEPF은 이들 효소 활성 억제를 유의적으로 차단하였다. 이 결과는 EEPF가 D-gal 처리에 따른 항산화 효소 활성의 감소에 대한 전반적인 보호 효과가 있었음을 시사한다. 관찰된 D-gal에 의한 C2C12 세포의 항산화 효소 감소에 대한 EEPF의 차단 효과가 ROS 생성의 차단과 직접 연관성이 있는지를 조사하기 위하여 DCF-DA 염색을 통한 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과 EEPF가 세포 내 항산화 시스템의 활성 유지를 통하여 ROS의 생성을 차단하였음을 알 수 있다.

미토콘드리아는 산화적 스트레스에 의한 ROS 생성을 담당하는 주요 세포 내 소기관이며, 세포 노화는 미토콘드리아 ROS 생성의 증가와 직접적인 연관성을 가진다^42,43). 이를 바탕으로 JC-1 염색을 사용하여 MMP를 조사하였다. 그 결과 ROS 생성의 차단 효과가 MMP 소실 차단과 최소한의 연관성이 있음을 알 수 있었다. 그러나 D-gal에 의한 ROS의 축적이 mitochondrial ROS의 과도한 생성의 결과인지, 그리고 이와 연관된 에너지 대사와 관련하여 추가적인 연구가 요구된다.

한편, 세포 노화의 특징 중 하나가 β-galactosidase 활성의 증가인 것으로 알려져 있는데, D-gal이 처리된 C2C12 세포에서도 이러한 현상이 관찰되어 노화 근육세포 모델로서 널리 사용되고 있다^36,41). 본 연구에서도 이들 선행 결과와 유사하게 D-gal에 노출된 C2C12 세포에서 증가된 β-gal의 활성이 관찰되었으며, 앞선 실험들에서 EEPF는 항산화 효소들의 활성을 유지하면서 미토콘드리아 기능 손상 억제와 연관된 ROS의 생성을 차단하였기에, 이러한 효능들이 세포 노화 억제에 관여하는지를 조사하였다. 실험 결과 EEPF는 근육세포에 대한 노화 방지 효과를 나타내었다. 또한 세포 노화의 대표적인 특징 중의 하나는 DNA손상으로, 축적된 DNA손상은 다시 세포 노화를 촉진한다^43,44). DNA손상은 세포 노화 과정과 밀접한 관련이 있으며, D-gal에 의한 세포 노화 촉진 과정에서도 DNA손상이 동반됨이 잘 알려진 바 있다^45-47). 그리고 ROS의 축적은 DNA 산화적 손상을 유발하며, D-gal에 의한 DNA 손상은 ROS의 축적과도 밀접한 연관성을 가진다^48,49). 본 연구에서 조사한 γ-H2AX를 형성하는 히스톤 변이체 H2AX Ser-139 잔기의 인산화는 DNA 이중 가닥 절단 유도 검출을 위한 유용한 마크로 적용되고 있으며^50,51), D-gal에 의한 DNA 손상의 지표로도 활용되고 있다^46,52). 이를 바탕으로 본 연구에서는 EEPF의 항노화 활성이 DNA 손상 차단과 연관성이 있는지의 여부를 조사하기 위하여 대표적인 DNA 손상 마크인 γ-H2AX^50,51)의 발현에 미치는 D-gal의 영향을 조사하였다. 그 결과 자소엽 수용성 추출물이 인간 각질세포와 피부 섬유아세포에서 산화적 스트레스에 의한 DNA 손상을 보호한다는 이전 연구와 잘 일치되었다^33,53). 또한 자소엽의 DNA 손상 보호 효과는 ROS 생성의 차단과 연관성이 높기 때문에 EEPF의 항산화 활성이 최소한 D-gal 유도 DNA 손상 억제에 중요하게 작용하였을 것으로 추측된다.

상기의 연구 결과에서 확인한 D-gal에 대한 EEPF의 항노화 활성에 대한 추가적인 근거를 제시하기 위하여 대표적인 SASP를 생성하는 신호 단백질이면서 세포 증식 억제 단백질인 p16, p53 및 p21의 발현^54,55)에 미치는 영향을 조사하였다. 그 결과 EEPF는 D-gal 처리에 의해 증가된 SASP 단백질인 p16, p53 및 p21의 발현^54,55) 또한 효과적으로 차단하였다. 이를 통해 EEPF의 항노화 활성은 SASP 단백질의 발현 변화와 직접적인 연관성이 있음을 알 수 있었다.

또한 본 연구에서는 선행 연구 결과와 일치되게⁵⁶⁾ 두 cytokine의 생성이 D-gal 처리에 의해 증가하였고, 이는 이들 cytokine의 발현 증가에 의한 것이었다. 따라서 EEPF에 의한 D-gal 유도 SASP cytokine의 생성 억제는 그들 단백질의 발현 차단에 의한 것임을 의미한다.

D-gal에 의한 IL-6 및 IL-18과 같은 SASP 및 염증성 cytokine의 발현은 NF-κB에 의하여 전사 수준에서 조절되는데^57,58), 본 연구 결과 D-gal은 세포질에서 핵으로의 NF-κB 전이를 촉진시켰으며, 이 과정에는 IκBα의 발현 감소 및 NF-κB의 활성을 의미하는 인산화가 동반되었다. 선행 연구의 결과에서처럼^36,59), EEPF가 D-gal에 의한 NF-κB의 인산화에 따른 핵으로의 이동을 차단하여 SASP cytokine의 전사 활성을 억제하였고, 이는 세포 노화의 억제에 기여하였을 것이다. 자소엽의 항염증 효능은 NF-κB 신호계 활성의 저해와 밀접한 연관성이 있음을 알 수 있었다(Fig. 8).

Fig. 8. Schematic summary for the action mechanism of EEPF on D-gal-induced cellular senescence in C2C12 myoblasts. EEPF: ethanol extract of Perilla frutescens leaf.

이상의 결과로 EEPF의 항노화 활성은 항산화 활성과 직접적인 연관성이 매우 높음을 알 수 있다. ROS 생성의 억제는 세포 내 항산화 시스템의 활성 유지에 의한 것으로 추정되지만, 이에 대한 핵심 조절 인자의 역할에 대한 규명이 요구되며, EEPF의 항염증 활성 연관 NF-κB 조절자로서 ROS의 역할에 대한 추가적인 연구가 요구된다. 아울러 EEPF 내에 포함된 생리활성 물질의 탐색과 자소엽의 항노화 활성에 대한 동물 모델에서의 효능 검증 또한 필요하다.

• 본 연구에서는 EEPF가 세포 노화를 지연시키는 관련 기전을 조사하기 위하여 D-gal 유도 C2C12 근원세포 노화 모델을 사용하였다.

• 세포 독성이 없는 조건에서의 EEPF는 D-gal이 처리된 C2C12 세포의 세포 생존율의 감소를 유의적으로 억제하였으며, 대표적인 세포 증식 표지 인자인 PCNA 발현의 감소를 증가시켰다.

• EEPF는 D-gal에 의해 유도된 세포사멸을 유의하게 차단하였고, 감소된 CAT, GSH-Px, T-AOC 및 SOD의 활성을 회복시켰다.

• EEPF는 C2C12 세포에서 D-gal에 의해 증가된 β-gal 활성을 저하시키고, 증가된 DNA 손상과 p16, p53 및 p21과 같은 SASP 단백질 발현 증가를 차단하였다.

• EEPF는 D-gal에 의한 염증성 cytokine인 IL-6 및 IL-18의 생성 및 그들의 발현을 억제하였다.

따라서, EEPF에 함유된 구성 성분 분석과 in vivo 동물 모델에서의 검증이 요구되나, 본 연구의 결과는 EEPF가 근육 노화의 예방 및 치료를 위한 잠재적인 후보로서 사용될 수 있음을 의미한다.