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J Korean Med Rehabi 2018 Apr; 28(2): 21-35  
A Study on Antibacterial Activity of Daehwanggeonwoo-san(Dahwangqianniu-san) Ethanol Extract against Methicillin-Resistant Staphylococcus Aureus
Published online April 30, 2018
Copyright © 2018 The Society of Korean Medicine Rehabilitation.

Ju-yeong Park*, Yong-su Na*, Gong-cheon Oh*, Sang-mi Lee*, Byeong-kwon Choi*, Yoon-seung Lee, and Yung-sun Song

* Department of third medicine of Korean Medicine, professional graduate school of Oriental medicine, Won-kwang University,
Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, Colleage of Korean Medicine, Won-kwang University
Correspondence to: Yung-Sun SONG, Department of Rehabilitation Medicine of Korean Medicine, College of Korean Medicine, Won-Kwang University, 99, Garyeonsan-ro, Deokjin-gu, Jeonju 561-851, Korea TEL (063) 270-1070 FAX (063) 270-1594 E-mailyssong@wku.ac.kr
Received: March 18, 2018; Accepted: April 3, 2018
This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/by-nc/3.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
Abstract

Objectives:

The objective of this study is to determine the antimicrobial effect of Daehwanggyeonu-san(Dahwangqianniu-san,DGE) and synergistic effects with antibiotics oxacillin, ampicillin, and gentamicin against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus(MRSA).

Methods:

The antibacterial activity of DGE extract was evaluated againest MRSA strains by using the Disc diffusion method, broth microdilution method(minimal inhibitory concentration; MIC), checkerboard dilution test. The checkerboard dilution test was used to examined synergetic effect of oxacillin, ampicillin, gentamicin, ciprofloxacin with DGE extract.

Results:

DGE showed antimicrobial activity against MRSA with an MIC value of 125∼250 μg/mL. In the checkerboard test, the interation of DGE with all tested antibiotics produced almost synergy or partial synergy against MRSA.

Conclusions:

This study shows that DGE reduced the MICs of several antibiotics tested, and a remarkable antibacterial effect of DGE, with membrane permeability enhancers and ATP synthase inhibitors. This study can be a valuable source for the development of a new drug with low MRSA resistance.

Keywords : Daehwanggyeonu-san(Dahwangqianniu-san,DGE), methicillin-resistant Staphylococcus aureus(MRSA), antibacterial effect, MIC
서론

인간의 거의 모든 포도상구균성 질병은 증식할 때 포도상 세포군집을 형성하는 통성 혐기성 구균인 Staphylococcus aureus(S. aureus)에 의해서 일어난다. S. aureus는 건강한 사람 또는 가축의 피부와 비공에 상재하여 이 중 절반 이상이 식중독을 일으키는 내열성의 장독소(enterotoxin)를 생산한다1-3). 1940년대 초반 이래로 황색포도상구균 감염증의 치료에 항균력이 우수한 penicillin, methicillin 등의 항생제를 사용하여 왔으며, 1961년 영국에서 MRSA(methicillin-resistant Staphylococcus aureus) 처음 보고 되었으며, 1981년 국내에서 처음 보고된 이래로 대표적인 병원감염균주인 MRSA는 국내 병원들의 임상 검체로부터 분리한 황색포도상구균의 70%를 차지하고, 중환자실 분리균주 중 황색포도상구균의 80%를 차지하고 있다4).

항생제의 과다 사용은 다제내성균의 출현 및 제어 실패의 중요한 원인이 되는 만큼 주요 의료관련 감염 원인균의 항균제 내성발현기전, 항균제 내성 전파방지를 위한 내성획득기전, 병원체의 분자 역학적 분석을 통한 내성균 전파 규명을 위해 노력해야 할 것이다5). 임상에서 항균 및 항암치료 효과를 상승시키기 위해 교체 내성(cross-resistance)이 없고, 작용 기전이 서로 다른 약제를 사용하는 복합요법이 주로 이용되고 있음에 따라 본 연구에서는 이러한 항생제 내성문제를 낮추어주기 위한 천연물 유래 항균물질의 가능성을 알아보고자 한다6-8).

大黃牽牛散은 『素問病機氣宜保命集』9) 卷中 「熱論第十四」에 최초로 기재되었으며, 『東醫寶鑑』10)에 수록된 처방으로 “治相火遊走臟腑, 大便秘結”이라 하였다. 처방구성은 大黃과 牽牛子로 되어있으며, 大黃은 瀉下作用, 淸熱凉血의 약리학적 효능을 가지고 있어, 항균, 항염, 항바이러스, 항종양 등의 다양한 효능이 있다고 알려져 있다11-14). 牽牛子는 瀉下祛積, 逐水退腫, 殺蟲의 약리학적 효능을 가지고 있어, lipopolysaccharide에 의해 유도된 RAW 264.7 cell에서 염증억제 효과, 간기능 개선효과 등이 보고 된 바 있다15,16). 이와 같이 大黃과 牽牛子에 단미에 대한 효과는 보고되고 있지만 복합제제인 大黃牽牛散에 대한 연구는 아직까지 보고된 바가 없다.

이에 저자는 大黃牽牛散의 Disc 확산 실험을 통해 MRSA에 대한 항균활성을 검증하였으며, 최소억제농도(MIC)를 측정하여 기존 항생제와 大黃牽牛散 추출물을 병행처리 하였을 때 synergy effect 및 partial synergy effect를 조사하였고, 大黃牽牛散의 항균활성이 세포막 투과성과 ATPase 억제에 연관성이 있는가를 실험하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법

1. 大黃牽牛散의 제조

大黃牽牛散은 『東醫寶鑑』10)의 처방을 기준으로 大黃 10 g, 牽牛子 5 g을 3첩 분량 45 g을 70% ethanol 500 mL로 추출하여 감압농축, 동결건조의 과정을 거쳐 18.8%의 수득률을 취했다(Table I).

Table I. The Composition of Daehwanggyeonu-san (Dahwangqianniu-san).

 Herbal name  Pharmacognostic name  Weight 
大黃Rhei Rhizoma10 g
牽牛子Pharbitidis Semen5 g

2. 시약

Mueller-Hinton agar(MHA)와 Mueller-Hinton broth(MHB)는 Difco™ (Baltimore, MD, USA)에서, Tris-(hydroxymethyl) aminomethane은 AMRESCO(San Francisco, CA)에서, Sodium azide(NaN3)는 Fluka (Neu-Ulm, Germany)에서, 항생제 oxacillin & ampicillin & gentamacin & ciprofloxacin과 Triton X-100, N,N-dicyclohexylcarbodimide(DCC)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, USA)에서 구입하여 실험에 사용하였다.

3. 균주 및 배양

본 실험에 사용한 표준균주(type strain) ATCC 33591은 American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, CCARM 3090, 3091, 3095, 3102는 서울여대 항생제 내성 균주은행으로부터, DPS-1,2,3은 원광대학교 병원 성형외과에서 분양받아 임상균주로 사용하였다.

균주는 –79°C 냉동고에서 30% glycerol에 보관하다가, Mueller-Hinton agar(MHA)에 접종한 후 37°C 항온기(incubator)에서 24시간 배양하여 실험에 사용하였다.

4. 항균활성 측정

1) 디스크 확산법(Disc diffusion method)

大黃牽牛散 에탄올추출물(DGE)의 항균효과는 디스크 확산법을 통해 MRSA에 대한 항균활성을 측정하였다17-19). 고압 멸균된 MHA에 24시간 배양된 균 100 μl를 골고루 도말하여 최종적으로 1.5 × 105 CFU/mL이 되게 하였다. 다음으로 멸균 된 paper disc(6 mm)에 DGE(25 μg, 50 μg, 100 μg, 200 μg)와 AP 10 μg을 각각 20 μL씩 주입하여 완전히 흡수시킨 후 37℃ incubator에서 24시간 배양시켜 paper disc 주위에 형성된 억제직경을 측정하였다.

2) 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)

최소억제농도(MIC)는 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI 2000) 방법에 따라 액체배지 희석법을 통해 측정하였다20). DGE를 액체배지에 농도별로 희석하여, 여기에 탁도 0.5 McFarland 1.5 × 108 CFU/mL을 기준으로 10 μl씩 접종하여 최종적으로 1.5 × 105 CFU/well이 되게 하였다. 다음으로 37°C 항온기에서 24시간 배양 후 미생물이 증식되지 않는 가장 낮은 약물의 농도를 MIC로 측정하였다21,22).

3) 약물병용효과(Fractional inhibitory concentration index, FICI)

DGE와 항생제의 병용효과를 보기위해 checkerboard dilution test를 실시하였다. 상용 항생제는 oxacillin (OX), ampicillin (AP), gentamicin (GT). ciprofloxacin (CP)이며 상기 액체배지 희석법과 동일한 방법으로 항생제를 병합하였을 때 MIC를 측정하였다.

FICI 산출기준은 다음과 같다22,23).

FICI = FICA+FICB = A/MICA+B/MICB

(MICA: 약물A의 MIC, MICB: 약물B의 MIC, A: 약물B를 병용한 약물A의 농도, B: 약물A를 병용한 약물B의 농도)

FICI<0.5, synergy;

0.5≤FICI<0.75, partial synergy;

0.75≤FICI<1.0, additive effect;

1.0≤FICI<4.0, no synergy;

FICI>4.0, antagonism.

4) 생장곡선 분석(Growth curve assay)

DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP를 병용했을 때 MRSA 증식 변화를 보기위해 시간에 따른 MRSA의 생장곡선을 흡광도법(optical density, OD600)으로 측정하였다24,25).

5) 세포막 투과성(cytoplasmic membrane permeability)과 Adenosine triphosphate(ATP) synthase 억제

DGE의 항균활성이 세포막 투과성 강화제와 ATP synthase 저해제를 병합하였을 때 활성의 변화를 보기 위해 detergent인 Triton X-100(TX)과 Tris-(hydroxymethyl) aminomethane (Tris)및 ATP synthase inhibitor를 사용하였다.

TX는 non-ionic detergent로 막 가용화 기능을 높임으로써 항생제 감수성을 증가시킬 수 있으며, TX와 Tris는 막투과성 증진제로 사용하였다26-27).

N,N-Dicyclohexylcarbodiimide(DCCD)와 sodium azide (NaN3)는 F0-F1-ATP synthase(F0F1)를 저해함으로써 ATP의 대사를 억제하는 것으로28), DGE의 항균활성이 MRSA의 ATP-dependent transport systems에 관여하는지 보기 위해 사용하였다.

5. 통계분석

모든 실험은 3회 이상 반복으로 이루어졌으며, 실험결과는 각 항목에 따라 평균치±표준편차 (SEM)를 구하여 그 유의성은 Student’s t-test 분석법을 이용하여 신뢰수준 95% (p < 0.05)에서 통계적 유의차를 평가하였다.

결과

1. 디스크 확산법(Disc diffusion method)

MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 대한 DGE의 항균효과는 디스크 확산법을 통해 나타냈다. DGE의 100 μg/20 μL 및 200 μg/20 μL에서 유효한 항균활성을 나타냈다(Fig. 1-3).

Fig. 1.

Diameter of inhibition zone(mm) of DGE against MRSA(ATCC 33591).


Fig. 2.

Diameter of inhibition zone(mm) of DGE against MRSA(CCARM 3091).


Fig. 3.

Diameter of inhibition zone(mm) of DGE against MRSA(DPS-2).


2. 최소억제농도(Minimum inhibitory concentration, MIC)

DGE의 항균활성은 최소억제농도(MIC)를 통해 확인하였다. MRSA 8균주에 대한 DGE의 최소억제농도는 125∼250 μg/mL이었다(Table II).

Table II. Antimicrobial Activity of DGE Against 8 Strains of MRSA.

StrainsMIC (μg/mL)

 DGE  OX  AP  GT  CP 
25062.51251.950.48>
 CCARM 3090 2501,00015.60.4831.25
CCARM 309112550031.251,0007.8
CCARM 309525025015.6125250
CCARM 310212525025025062.5
DPS-12503.915.631.250.48>
DPS-21253.915.662.5125
DPS-325050015.60.48>31.25

OX, oxacillin; AP, ampicillin; GT, gentamacin; CP, ciprofloxacin..


3. 약물병용효과(Fractional inhibitory concentration index, FICI)

1) DGE와 oxacillin(OX)의 병용효과

DGE와 베타락탐계(β-lactams) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 베타락탐계 항생제인 OX를 병용한 결과, MRSA 4균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table III). 15.6∼125 μg/mL DGE에서 OX의 농도를 2∼32배 감소시켰다.

Table III. Results of the Combination of DGE and OX Against MRSA..

Strains agent MIC (μg/mL) FIC  FICI  Outcome 
 Alone  Combination 
ATCC 33591DGE2501250.50.56Partial S
OX62.53.90.06
 CCARM 3090 DGE25015.60.060.56Partial S
OX1,0005000.5
CCARM 3091DGE25062.50.250.31S
OX50031.250.06
CCARM 3095DGE25062.50.250.28S
OX2507.80.03
CCARM 3102DGE2501250.51.0AE
OX2501250.5
DPS-1DGE2502501.02.0NS
OX3.93.91.0
DPS-2DGE2502501.02.0NS
OX3.93.91.0
DPS-3DGE2502501.02.0NS
OX5005001.0

OX; oxacillin, S, synergy; AE, additive effect; NS, no synergy..


2) DGE와 ampicillin(AP)의 병용효과

DGE와 베타락탐계(β-lactams) 항생제인 AP를 병용한 결과, MRSA 6균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table IV). 15.6∼125 μg/mL DGE에서 AP의 농도를 2∼64배 감소시켰다.

Table IV. Results of the Combination of DGE and AP Against MRSA..

Strains agent MIC (μg/mL) FIC  FICI  Outcome 
 Alone  Combination 
ATCC 33591DGE25015.60.060.56Partial S
AP12562.50.5
 CCARM 3090 DGE2501250.50.51Partial S
AP15.60.240.01
CCARM 3091DGE2501250.50.75Partial S
AP31.257.80.25
CCARM 3095DGE25062.50.250.5S
AP15.63.90.25
CCARM 3102DGE25062.50.250.75Partial S
AP2501250.5
DPS-1DGE2502501.02.0NS
AP15.615.61.0
DPS-2DGE25015.60.060.18S
AP15.60.970.12
DPS-3DGE2502501.02.0NS
AP15.615.61.0

AP; ampicillin, S, synergy; NS, no synergy..


3) DGE와 gentamicin(GT)의 병용효과

DGE와 아미노글리코사이드계(aminoglysides) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 GT를 병용한 결과, 실시한 MRSA 7균주 중 5균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table V). 7.8∼62.5 μg/mL DGE에서 GT의 농도를 2∼8배 감소시켰다.

Table V. Results of the Combination of DGE and GT Against MRSA..

Strains agent MIC (μg/mL) FIC  FICI  Outcome 
 Alone  Combination 
ATCC 33591DGE2507.80.031.03NS
GT1.951.951.0
 CCARM 3090 DGE2501.950.01>1.01>NS
GT0.480.481.0
CCARM 3091DGE25015.60.060.56Partial S
GT1,0005000.5
CCARM 3095DGE25062.50.250.5S
GT12531.250.25
CCARM 3102DGE25062.50.250.75Partial S
GT2501250.5
DPS-1DGE2507.80.030.15S
GT31.253.90.12
DPS-2DGE25062.50.250.5S
GT62.515.60.25
DPS-3DGE250----
GT0.48>--

GT; gentamicin, S, synergy; NS, no synergy..


4) DGE와 ciprofloxacin(CP)의 병용효과

DGE와 퀴놀론계(quinolons) 항생제의 상승효과를 조사하기 위해 CP를 병용한 결과, 실시한 MRSA 6균주에서 synergy effect및 partial synergy effect를 나타냈다(Table VI). 1.95∼125 μg/mL DGE에서 CP의 농도를 2∼32배 감소시켰다.

Table VI. Results of the Combination of DGE and CP Against MRSA..

Strains agent MIC (μg/mL) FIC  FICI  Outcome 
 Alone  Combination 
ATCC 33591DGE250----
CP0.48>-
 CCARM 3090 DGE2501.950.1>0.13S
CP31.250.970.03
CCARM 3091DGE25031.250.120.37S
CP7.81.950.25
CCARM 3095DGE25015.60.060.31S
CP12531.250.25
CCARM 3102DGE25062.50.250.75Partial S
CP62.531.250.5
DPS-1DGE250----
CP0.48>-
DPS-2DGE2501.950.1>0.13S
CP2507.80.03
DPS-3DGE2501250.50.53Partial S
CP15.60.480.03

CP; ciprofloxacin, S, synergy..


4. Growth curve assay

DGE(250 ug/mL)와 항생제 OX, AP, GT, CP를 병용하였을 때 MRSA의 생장곡선은 Fig. 4-7에 나타냈다.

Fig. 4.

Growth Curves for MRSA(CCARM 3091) in the Presence or Absence of DGE and Oxacillin(OX). Bacterial Cell Growth was Measured by Using OD at 600 nm at Indicated Time Points.


Fig. 5.

Growth Curves for MRSA(DPS-2) in the Presence or Absence of DGE and Ampicillin(AP). Bacterial Cell Growth was Measured by Using OD at 600 nm at Indicated Time Points.


Fig. 6.

Growth Curves for MRSA(DPS-1) in the Presence or Absence of DGE and Gentamacin(GT). Bacterial Cell Growth was Measured by Using OD at 600 nm at Indicated Time Points.


Fig. 7.

Growth Curves for MRSA(CCARM 3095) in the Presence or Absence of DGE and Ciprofloxacin(CP). Bacterial Cell Growth was Measured by Using OD at 600 nm at Indicated Time Points.


1) DGE + OX에서 MRSA(CCARM 3091)의 생장곡선

DGE와 OX의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 OX군은 비교적 정상적인 증식상태를 나타냈으며 DGE군은 약물활성에 의해 증식이 억제되었으나 8시간 이후부터 MRSA 증식이 점차 증가하는 양상을 나타냈다. 반면에 DGE와 OX를 병용한 군에서는 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 4).

2) DGE + AP에서 MRSA(DPS-2)의 생장곡선

DGE와 AP의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 AP와 DGE군은 약물활성에 의해 저해되었으나 동일한 양상을 나타냈다. 반면에 DGE와 AP를 병용한 군에서는 완전히 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 5).

3) DGE + GT에서 MRSA(DPS-1)의 생장곡선

DGE와 GT의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군과 GT군은 비슷한 증식양상을 나타냈으나 DGE군과 DGE와 GT병용 군은 약물활성에 의해 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 6).

4) DGE + CP에서 MRSA(CCARM 3095)의 생장곡선

DGE와 CP의 1/2 MIC를 단일 및 병용하여 24시간동안 처리한 결과, 약물을 처리하지 않은 군에 비해 CP군은 비교적 정상적인 증식상태를 나타냈으며 DGE군은 약물활성에 의해 증식이 억제되었으나 8시간 이후부터 MRSA 증식이 점차 증가하는 양상을 나타냈다. DGE와 CP를 병용한 군에서는 확연하게 억제되다가 8시간 이후 점차 증가하는 MRSA의 증식을 보여주었다(Fig. 7).

5. DGE와 막 투과성 증진제 및 ATP synthase 억제제

1) DGE와 막 투과성 증진제의 효과

DGE의 항균활성과 막 투과성 증진제의 효과를 조사하기 위해, 7.8 μg/mL DGE와 0.0001% TX 및 62.5 μg/mL Tris를 각각 병용하였다. 그 결과, 병용처리한 약물에서 MRSA(ATCC 33591)의 생존력을 각각 70%와 85%로 감소시켰다(Fig. 8, 9).

Fig. 8.

Effect of the Membrane-Permeabilizing Agent TX on the Susceptibility of MRSA(ATCC 33591) to DGE. The Viability of Bacteria was Determined Spectrophotometrically(Optical Density at 600 nm, OD600) After Incubation for 24 hr with 7.8 μg/mL DGE and 0.0001% TX. The Data are Average of Triple-Independent Experiments. *p < 0.01 Compared to Control(CON).


Fig. 9.

Effect of the Membrane-Permeabilizing Agent TRIS on the Susceptibility of MRSA(ATCC 33591) to DGE. The Viability of Bacteria was Determined Spectrophotometrically(Optical Density at 600 nm, OD600) After Incubation for 24Hr with 7.8 μg/mL DGE and 62.5 μg/mL Tris. The Data are Average of Triple-Independent Experiments. *p < 0.01 Compared to Control(CON).


2) DGE와 ATP synthase 억제제의 효과

ATP synthase를 감소시키는 대사억제제로써, DCCD와 NaN3을 7.8 μg/mL DGE와 각각 병용한 결과, 각각 82%와 47%의 억제율을 나타냈다(Fig. 10, 11).

Fig. 10.

Effect of the ATP Synthase Inhibitor DCCD on the Susceptibility of MRSA(ATCC 33591) to DGE. The Viability of Bacteria was Determined Spectrophotometrically(OD600) after Incubation for 24 Hr with 7.8 μg/mL DGE and 62.5 μg/mL DCCD. The Data are Average of Triple-Independent Experiments. *p < 0.01 Compared to Control(CON).


Fig. 11.

Effect of the ATP Synthase Inhibitor NaN3 on the Susceptibility of MRSA(ATCC 33591) to DGE. The Viability of Bacteria was Determined Pectrophotometrically(OD600) after Incubation for 24Hr with 7.8 μg/mL DGE and 50 μg/mL NaN3. The Data are Average of Triple-Independent Experiments. *p < 0.01 Compared to Control(CON).


고찰

황색포도상구균(Staphylococcus aureus, S. aureus)는 농가진, 종기, 상처의 농양 등 화농성의 피부감염 뿐 아니라 결핵, 폐렴 및 독성 쇼크증후군 등의 중증감염을 포함한 광범위한 감염을 일으킬 수 있다29,30). 병원성 S. aureus는 높은 2차 감염률의 원인균으로 혈액응고효소(coagulase), 백혈구사멸소(leucocidin)와 용혈소(hemolysin) 등의 전염병 발생에 중요한 세포외 단백질을 생성해낸다31-33). 이중 반합성 penicillin인 methicillin에 내성을 보이는 것을 methicillin 내성 황색포도상구균(methicillin-resistant Staphylococcus aureus; MRSA)이라 한다34). S. aureusβ-lactam 계열 항생제의 표적인 새로운 penicillin binding protein(PBP 2a)을 생성하여 mec 유전자에 의해 β-lactam 항생제와의 친화도가 낮은 새로운 페니실린 결합 단백(penicillin binding protein, PBP 2a)을 생성하여 methicillin에 내성을 가지게 된다35-37).

세계 곳곳에서 항생제 내성으로 인해 다제내성균이 발생하고 있다. 항생제의 과다 사용은 다제내성균의 출현 및 제어 실패의 중요한 원인이 되는 만큼 적절한 대책이 시급하다38,39). 최근 국내병원 중환자실에서 분리되는 S. aureus에서 메티실린(methicilllin)내성이 90%로 보고되는 등 여러 계열의 항생제에 다제내성을 보이고 있어 이러한 다제내성균의 증가와 확산은 기존의 항생제로는 더 이상 치료하기 어려운 상황에 직면하게 했다40,41). 최근 연구동향은 기존의 항균제들과는 다른 차별화된 새로운 작용기전을 갖거나 기존 항균제의 구조를 변형시켜 내성균에 효과를 보이는 광범위 스펙트럼 항생제를 개발하는 것이다. 또한 항생제 내성 발생으로 인한 항생제의 시장 판매주기가 짧은 점으로 개발비율이 낮은 점을 고려하여야 한다. 항균제 병용요법은 1차 단독요법의 실패를 극복, 효과적인 항균 범위를 확보하기 위한 2차 항생제에 있어 다제내성균에 유효한 항생효과를 발휘하여야 하며 병용 약제와의 상호작용 등 임상적 특성도 고려되어야 한다42-44).

大黃牽牛散은 『東醫寶鑑』에 수록된 처방으로 大黃牽牛散을 이루는 개별 약재의 본초학적인 효능을 살펴보면, 大黃은 蓼科(여뀌과; Polygonaceae)에 속한 多年生高大草本인 장군풀 및 同屬近緣植物의 根 및 根莖이다. 苦, 寒, 無毒하고 脾, 胃, 大腸, 肝, 心 五經에 작용하며 攻積導滯, 瀉火解毒 行瘀通經, 淸利濕熱 등의 효능이 있어 實熱便秘, 積滯腹痛, 腸癰, 瀉利不爽, 瘀血經閉, 濕熱黃疸 등의 병증을 치료한다. 牽牛子는 旋花科(메꽃과; Convolvulaceae)에 속한 1年生攀援草本인 나팔꽃 및 둥근잎나팔꽃의 成熟한 種子이다. 苦, 辛, 寒, 大毒하고 肺, 腎, 大腸 三經에 작용하며 瀉下祛積, 逐水退腫, 殺蟲, 瀉肺逐痰 등의 효능이 있어 水腫脹滿, 二便不通, 諸蟲病, 痰飮積聚, 氣逆咳喘 등의 병증을 치료한다45).

개별 약재의 성분 및 이전 연구를 살펴보면, 大黃의 주요성분은 glucosides rhein-8monoglucoside, physcion monoglucoside, aloeemodin monoglucoside, sennoside tannin, gallic acid, calechin 등으로 보고되었다46). 大黃에 관련된 이전 연구로는 최 등47)이 지방조직의 염증 및 인슐린 저항성에 미치는 영향을 알아보았으며, 장 등48), 조 등49), 이 등50) 이 大黃의 혈당 및 혈청 지질 개선에 효과가 있다는 발표가 있었으며, 윤 등51) 은 HepG2 Cell에 대한 항암효과, 박 등52)의 항산화 효과와 MMP-1의 활성 저해 효과에 대한 실험 등 다양한 실험적 연구가 있었다. 또한 大黃에 대한 항균활성에 대한 연구로는 이53)의 大黃에서 분리된 플로로탄닌의 여드름균에 대한 항균 및 시너지효과를 보고하였으며, 엄54)의 MRSA에 대한 항균물질의 화학구조 구명 및 작용기작을 해석한 연구가 있으며, 최55)의 大黃에서 추출한 emodin의 MRSA에 대한 항균작용이 보고되고 있고, 이와 같이 항균효과에 대해 많은 보고가 있었다. 牽牛子의 대표 성분은 Gibberel- lenic acid, Pharbitin, Nilic acid, Pharbitic acid 등이 함유되어 있다고 보고되어져 있으며56), 牽牛子의 성분 중 Pharbitin은 腸道, 腎腸, 중추신경 계통 등에 손상을 일으킨다57). 牽牛子에 대한 실험적 연구로는 고 등15), 윤 등58)이 소염 및 해열작용에 미치는 영향을 보고하였고, 김 등59)이 조골세포 분화에 미치는 영향을 연구하였고, MRSA에 대한 항균작용에 대한 보고는 없었다. 현재까지 大黃牽牛散에 대한 연구는 보고되지 않았으며, 항균활성 연구가 보고된 大黃에 瀉下祛積, 殺蟲의 효능을 가진 牽牛子가 처방되어 보다 높은 항균효과를 높일 수 있기를 기대하는 大黃牽牛散에 대한 연구가 필요하리라 사료된다.

본 실험은 DGE의 MRSA에 대한 항균효과와 기존 항생제와의 상승작용 및 세포의 구조적 특성과 에너지대사에 기인하여 항균활성의 작용기작을 조사하였다. 大黃과 牽牛子의 두 약물로 이루어진 DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA ATCC 33591, CCARM 3091, DPS-2에 유효한 항균활성을 나타냈다. 또한 MRSA 표준균주와 임상균주를 포함한 8균주에서 우수한 항균효과를 나타냈다.

DGE를 항생제와 병용처리 하였을 때 MRSA에 대한 상승효과를 확인하기 위해 베타락탐계(OX & AP), 아미노글리코사이드계(GT) 및 퀴놀론계(CP) 항생제를 병합한 결과, 대부분 상승효과를 나타내었으며, DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP를 병용하였을 때 MRSA의 생장곡선을 분석한 결과, 병용한 군에서는 확연하게 억제된 MRSA의 증식을 보여주었다. 이는 DGE가 다제내성을 갖는 MRSA의 항생제 내성을 낮추어줄 수 있는 천연물 항균제로써의 가능성을 유추할 수 있었다21,60,61).

DGE의 항균활성과 막 투과성 증진제 및 ATP synthase 억제제 효과를 조사하기 위해, 7.8 μg/mL DGE와 0.0001% TX 및 62.5 μg/mL Tris를 각각 병용하였다. 그 결과, 병용처리한 약물에서 MRSA(ATCC 33591)의 생존력을 감소시켰으며, ATP synthase를 감소시키는 대사억제제로써, DCCD와 NaN3을 7.8 μg/mL DGE와 각각 병용한 결과, 억제율을 나타냈다. DGE의 항균활성은 세포막의 구조적 특성과 에너지대사 기능에 있어서 침투력이 상승했다. 세포벽 안쪽에서 세포질을 둘러싸고 있는 세포막(cytoplasmic membrane)은 세포 내외로 물질의 선택적 투과성을 부여한다. 이는 어떤 분자나 이온들은 쉽게 막을 통과할 수 있지만 어떤 것들은 제한을 받는다62). 大黃牽牛散과 병용투여 하였을 때 TX와 Tris가 MRSA의 막 표면 구조를 이완시켜 세포내로 침투하는 항생제의 이동을 증가시키는 데 기인하여 大黃牽牛散 항균활성의 침투력을 높여주었다고 사료된다. 세포막은 cytochrome oxidase, dehydrogenase, ATPase, protein synthetase 등 에너지 생산 및 물질 생산에 필요한 다양한 효소와 전자운반체를 갖고 있다. ATP synthase는 ADP와 인산을 합성하여 ATP를 만들어내는 반응 촉매효소로써 DCCD와 NaN3는 이러한 ATP 대사를 저해하는 데 기인하여 大黃牽牛散의 항균활성을 증진시켰을 것으로 사료된다.

위 실험들로 보아 大黃牽牛散 에탄올 추출물에는 MRSA를 저해할 수 있는 강한 항균효과가 있음을 확인하였고, 또한 기존의 항생제와 병용하였을 때 약물 상승효과를 볼 수 있어 MRSA에 대한 항생제 후보물질 중 하나로 大黃牽牛散 또는 大黃牽牛散과 항생제의 병용요법이 충분한 가치가 있음을, 더 나아가 기존 항생제의 사용을 감소시킬 수 있는 후보물질임을 기대할 수 있을 것으로 사료된다. 그러나 임상에서 실제 치료에 응용하기 위하여 향후 임상시험을 통한 항균효과 및 항생제 병용 효과에 대한 추가적인 연구가 필요할 것이라 사료된다.

결론

大黃牽牛散 에탄올추출물(DGE)의 Methicillin 내성 Staphylococcus aureus(MRSA)에 대한 항균활성을 측정하여 다음과 같은 결과를 얻었다.

  • DGE는 디스크 확산법을 통해 MRSA 세 균주에 대해 100 μg/20 μL 및 200 μg/20 μL에서 항균효과를 나타냈다.

  • DGE의 MRSA 최소억제농도는(MIC)는 125∼250 μg/mL 이었다.

  • DGE와 항생제 OX, AP, GT, CP의 병용결과, 大黃牽牛散 1.95∼125 μg/mL에서 상승효과를 나타냈으며, 항생제의 농도를 2배∼64배 낮추어주었다.

  • DGE는 TX와 Tris가 막투과성을 증가시켜 항균활성의 침투력을 증가시켰다.

  • DGE는 DCCD와 NaN3가 ATP 대사를 저해하여 항균활성이 증진되었다.

이상 실험 결과, 大黃牽牛散 에탄올추출물이 MRSA에 유효함과, 기존 항생제와의 상승효과로 항생제 농도를 낮추어줄 수 있어 다제내성 MRSA에 대한 항생제 후보물질로써 가능성을 시사하는 바이다.

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July 2018, 28 (3)

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