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J Korean Med Rehabi 2023 Jul; 33(3): 17-32  https://doi.org/10.18325/jkmr.2023.33.3.17
Antioxidant, Anti-inflammatory and Cartilage Regeneration Effects of Euiiin-tang
Published online July 31, 2023
Copyright © 2023 The Society of Korean Medicine Rehabilitation.

Hong-Tak Park, K.M.D., Young-Jun Kim, K.M.D., Woo-Seok Shon, K.M.D., Chang-Hoon Woo, K.M.D.

Department of Korean Medicine Rehabilitation, College of Korean Medicine, Daegu Haany University
Correspondence to: Chang-Hoon Woo, Department of Korean Medicine Rehabilitation, Pohang Korean Medical Hospital, College of Korean Medicine, Daegu Haany University, 411 Saecheonnyeon-daero, Nam-gu, Pohang 37685, Korea
TEL (054) 281-0055
FAX (054) 281-7463
E-mail jungwsungw@hanmail.net
Received: April 26, 2023; Revised: May 8, 2023; Accepted: July 3, 2023
Abstract
Objectives The purpose of this study was to investigate the antioxidant, anti-inflammatory and cartilage regeneration effects of Euiiin-tang water extract (EIIT) in the treatment of monosodium iodoacetate (MIA)-induced osteoarthritis in rats.
Methods Animal models were divided into five groups. The normal group didn’t do any treatments causing osteoarthritis. The control group was orally administerd distilled water instead of the drug, the positive control group used indomethacin 5 mg/kg, the EIIT 100 group used EIIT 100 mg/kg and the EIIT 200 group used EIIT 200 mg/kg, and seven rats were placed per group. We administered drug to rats for 2 weeks and analyzed oxidative stress-related proteins in joint tissue. Inflammation mediators and inflammatory cytokines induced by the activity of inflammation-related proteins were analyzed. In addition, the expression of anti-inflammatory cytokines and collagen-related factors were analyzed, and H&E staining and Safranin-O staining were performed to see the effect on histopathological changes.
Results 1) Oxidative stress-related proteins were significantly reduced. 2) Inflammationrelated proteins, inflammatory mediators and inflammatory cytokines were significantly reduced. 3) Anti-inflammatory cytokines were significantly increased. 4) Collagen proteolysis factors significantly decreased, and collagen degradation inhibitory factor was significantly increased. 5) EIIT administration significantly reduced cartilage degeneration and deformation in H&E staining, and reduced proteoglycan destruction in Safranin-O staining.
Conclusions From the above experimental results, it judges that Euiiin-tang has antioxidant, anti-inflammatory, and cartilage regeneration effects on osteoarthritis in rats induced by MIA.
Keywords : Osteoarthritis, Antioxidants, Mia protein, Rat
서론»»»

골관절염은 퇴행성 관절질환으로 초기에는 원섬유 형성(fibrillation)과 분열(disruption)의 소견을 보이다가 진행하면서 표면의 불규칙성은 갈라진 틈(cleft)을 형성하고, 이후에 열구(fissure)를 형성하여 연골하골까지 병변이 연장된다. 이런 과정과 더불어 연골의 기질도 효소에 의해 분해되고, 동화작용이 감소하고 이화효소 활성이 증가하여 연골 세포가 소실되며 연골층의 두께가 감소하게 된다1).

한의학에서는 『黃帝內經素問⋅痺論』에서 “風寒濕三氣雜至, 合而爲痺也. 其風氣勝者爲行痺, 寒氣勝者爲痛痺, 濕氣勝者爲着痺也”라고 하였고2), 『東醫寶鑑』3)에서도 이 내용을 따르며 골관절염을 痺證의 범주로 인식하였다. 인체 관절에 風, 寒, 濕의 邪氣가 침범하면 關節酸楚 및 疼痛, 重着, 腫大, 活動障礙를 주요 특징으로 하는 증상이 나타나며, 이에 한약과 봉독, 약침, 침, 뜸 및 태극권 등의 치료방법이 사용되고 있다4).

본 실험에 사용된 薏苡仁湯은 『明醫指掌』5)에 수록되어 있는 처방으로서 溫經通絡, 除濕宣痺하는 작용으로 內經에서 제시한 痺證 중 濕痺에 응용되었다. 본 연구에서는 기존의 연구에서 소염진통작용과 류마티스 관절염에 효과가 있다고 밝혀져 있으면서6), 전통적으로 류마티스 관절염에 사용해 온7) 薏苡仁湯이 MIA로 유발된 rat의 골관절염 치료에도 효과가 있을 것으로 생각되어 이 연구를 진행하게 되었다.

이에 저자들은 薏苡仁湯이 in vitro로 항산화에 미치는 영향을 먼저 확인하고, monosodium iodoacetate (MIA)로 우측 무릎관절의 골관절염을 유발한 rat에 薏苡仁湯 추출물을 투여한 후, 뒷다리 체중 부하의 변화에 대한 분석, 간 기능 지표 분석, 관절조직 내 산화적 스트레스와 관련된 단백질, 염증성 단백질과 매개인자, 염증성 및 항염증성 cytokine 발현, 콜라겐 관련 인자를 분석하고, 조직병리학적 검사를 진행하여 유의한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 시약

본 실험에 사용된 diethylene glycol, MIA, Folin-Ciocalteu’s phenol reagent, 7 mM 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS), dithiothreitol (DTT), 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), gallic acid, phenylmethylsulfonyl fluoride, potassium phosphate dibasic, sodium carbonate, indomethacin, naringin, sodium hydroxide, potassium phosphate monobasic 시약은 Sigma Aldrich Co. Ltd.에서 구입하였다. 마취제는 Virbac에서 구입한 Zoletil과 rompun (Bayer Korea Ltd.)을 혼합하여 사용하였다. Santa Cruz Biotechnology에서 1차 항체 p38 mitogen-activated protein kinase (p38), phospho p38 (p-p38), nuclear factor-κBp65 (NF-κBp65), interleukin (IL)-10, inducible nitric oxide synthase (iNOS), histone, phosphorylated inhibitor of κBα (p-IκBα), IL-4, β-actin, tumor necrosis factor (TNF-α), matrix metalloproteinase (MMP)-1과 MMP-13, inhibitor of κBα (IκBα), IL-6, p22phox, nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4 (NOX4), tissue inhibitor of metalloproteinases-1 (TIMP-1)을 구매하였으며, 2차 항체는 Gene Tex Inc.에서 구입하여 실험에 사용하였다. 그리고 Wako Pure Chemical Industries, Ltd.에서 protease inhibitor와 ethylene diamine tetraacetic acid (EDTA)를 구입하여 사용하였으며, Amersham GE Healthcare에서 ECL Western Blotting Detection Reagents와 nitrocellulose membrane을 구입하여 사용하였다. BCA protein assay kit는 단백질 정량을 위해서 Thermo Fisher Scientific에서 구입 후 실험에 사용하였다.

2) 동물

골관절염 유발에 사용되는 동물은 대한바이오링크에서 제공 받은 7주령(200~250 g) 웅성 Sprague-Dawley rat으로 실험 당일까지 물 및 고형 사료(Zeigler Bros Inc.)를 자유롭게 공급하였다. 본 연구는 약리학적 효과를 찾기 위한 초기 단계로 성 호르몬 주기에 영향을 받지 않는 약리학적 특성을 조사하기 위해 자성을 제외하고 웅성 rat만 선택했다. 습도(55±5%), 온도(22±2 ℃) 및 명암주기 12시간이 잘 유지되는 사육 환경에서 일주일 동안 적응된 후 본 실험에 투입되었다. 또한 대구한의대 동물실험윤리 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인(승인번호: DHU2020-040)을 받아 동물 실험을 진행하였다.

3) 약재

본 실험에서 사용된 薏苡仁湯을 구성하는 약재는 옹기한약국에서 구입한 후 적절한 선별 과정을 거쳐 사용하였으며 1첩 분량은 다음과 같다(Table I). 약재를 추출하는 방법은 기존 연구8)에서 제시된대로 동물실험에 사용될 양을 고려하여 薏苡仁湯 6첩 분량과 함께 첩당 용량의 10배수 증류수를 가하여 2시간 가열 추출하여 얻은 추출액을 여과한 후 감압 농축기를 이용하여(온도 50 ℃) 농축하고, 동결 건조한 후 薏苡仁湯 물 추출물(Euiiin-tang water extract, EIIT) 파우더 34.98 g을 얻었다(수득률 8.57%). 薏苡仁湯 물 추출물을 냉동보관(-80 ℃)하였다가 증류수에 녹인 후 실험에 사용하였다.

Composition and Amount of Euiiin-tang

Herb name Pharmacognostic name Amount (g)
薏苡仁 Coix lachryma-jobi var. ma-yeun (Roman.) Stapf. 20
蒼朮 Atractylodes lancea (Thunb.) DC. 8
麻黃 Ephedra sinica Stapf. 8
當歸 Angelica gigas Nakai 8
生薑 Zingiber officinale Rosc. 8
桂枝 Cinnamomum cassia Blume 6
芍藥 Paeonia lactiflora Pallas 6
甘草 Glycyrrhiza uralensis Fisch. 4
Total amount 68


4) 실험기기

본 실험에서 열탕추출기(DWT-1800T; Daewoong Bio), 동결건조기(FD5508, Ilsin, Korea), 전자체중계(CAS), rotary vacuum evaporator, vortex mixer (Buchi B-480, Switzerland), incapacitance tester (Ser No. 01/45/25; Linton instrument Co.), 냉장고속원심분리기(Mega17R; Hanil), Sensi-Q2000 Chemidoc (Lugen Sci Co., Ltd.), tissue grinder (Bio Spec Product), Microplate reader (Infinite M200 pro; Tecan), ATTO Densitograph Software (ATTO Corporation)를 사용하였다.

2. 방법

1) Total polyphenol과 total flavonoid 측정

Total polyphenol은 Folin-Denis 방법으로 함량을 측정하였다9,10). 10 µL의 시료, Folin-Ciocal-teu’s phenol reagent 50 µL, 증류수 790 µL를 혼합하여 실온에서 1분 동안 반응시킨 후 150 µL의 20% sodium carbonate를 넣어주었다. 실온의 환경에서 2시간 동안 반응시킨 다음 Microplate reader로 765 nm에서 흡광도를 측정한 뒤, 표준물질인 gallic acid로 표준 검량선을 구하고 total polyphenol 함량을 산출하였다.

Total flavonoid는 Lister 등11)의 방법으로 함량을 측정하였다12). Diethylene glycol 1 mL, 100 µL의 시료와 1 N NaOH 10 µL를 혼합하여 37 ℃의 환경에서 1시간 동안 반응시킨 다음 Microplate reader로 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 표준물질인 naringin으로 표준 검량선을 구하여 total flavonoid 함량을 산출하였다.

2) DPPH free radical 소거능 분석

薏苡仁湯 물 추출물의 항산화능을 평가하기 위해서 DPPH free radical 소거법을 활용하였다13,14). 60 µm DPPH 용액(100 µL)과 薏苡仁湯 물 추출물을 농도별로 희석한 용액(100 µL)을 혼합한 후 실온의 암실에 30분 동안 반응시켜 Microplate reader로 흡광도 540 nm에서 측정하였다. 본 실험에서 L-ascorbic acid는 양성대조군으로 사용하였으며, 아래의 식으로 계산하여 흡광도 값을 구하였다.

DPPH radical scavenging activity (%)=1ODsampleODcontrol×100

ODsample: absorbance of sample

ODcontrol: absorbance without sample


3) ABTS free radical 소거능 분석

薏苡仁湯 물 추출물의 항산화능을 평가하기 위해서 ABTS free radical 소거법을 활용하였다15,16). 2.4 potassium persulfate와 7 mM ABTS 시약을 혼합하여 암소 및 실온의 환경에서 약 16시간 이상을 방치한 후 ABTS+을 형성시켜 흡광도 415 nm에서 0.70±0.02 측정값이 되도록 에탄올로 희석하여 사용하였다. 희석된 ABTS 용액(95 µL)에 薏苡仁湯 5 µL를 가하여 15분 동안 방치하고 Microplate reader로 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 본 실험에 L-ascorbic acid는 양성대조군으로 사용하였으며, 아래의 식으로 계산하여 흡광도 값을 구하였다.

ABTS radical scavenging activity (%)=1ODsampleODcontrol×100

ODsample: absorbance of sample

ODcontrol: absorbance without sample


4) MIA에 의한 골관절염 유발

Zoletil mixture를 3.5 mg/kg 복강 투여하여 쥐를 마취시키고 오른쪽 무릎 주변을 깨끗이 제모 후 골관절염 유발을 위해 관절강 내에 insulin 주사기(BD 31G)를 사용하여 50 µL (80 mg/mL)의 MIA를 주입하였다. MIA 투여 일주일 후 골관절염 유발이 되었는지 확인하여 골관절염이 유발된 쥐만 선별하여 실험에 사용하였다.

5) 약물투여와 군 분리

실험군은 정상군, 대조군, 양성대조군, 의이인탕 저농도 및 고농도 투여군 등 5개의 군으로 분리했으며, 각 군당 7마리씩 무작위로 추출했다.

(1) 정상군(normal)

골관절염을 유발하지 않은 정상군

(2) 대조군(control)

MIA로 골관절염 유발 후 증류수를 경구 투여한 대조군

(3) 양성대조군(INDO)

MIA로 골관절염 유발하여 indomethacin을 5 mg/kg 투여한 INDO군

(4) 薏苡仁湯 저농도 투여군(EIIT100)

MIA로 골관절염 유발 후 薏苡仁湯을 100 mg/kg 투여한 EIIT100군

(5) 薏苡仁湯 고농도 투여군(EIIT200)

MIA로 골관절염 유발 후 薏苡仁湯을 200 mg/kg 투여한 EIIT200군

6) 체중, 식이섭취량 및 식이효율 측정

전자체중계를 이용하여 2일 간격으로 1번씩 동일한 시간과 조건에서 쥐의 체중을 측정하였고, 실험 종료일에 체중을 잰 뒤 실험 개시 전 체중을 제하여 체중의 증가량(body weight gain)을 계산하였다. 또한, 식이섭취량은 2일 동안 제공된 식이에서 섭취하고 남은 식이량을 제한 후 각 실험군의 하루 식이섭취량을 계산하였으며, 각 쥐의 체중 증가량을 동일한 사육 기간의 식이섭취량으로 나누어 실험군의 식이효율(food efficiency ratio)을 산출하였다.

(1) 체중
  • 각 실험군의 체중 변화: 2일 간격 1번씩 측정, 오전 동일 시간에 체중 측정 후 기록

  • 체중 증가량: Final body weight (g)-initial body weight (g)

(2) 식이효율

식이효율(%)=총 체중 증가량/총 식이 섭취량×100

7) 뒷다리 체중 부하 측정

뒷다리 체중 부하 측정은 관절염이 유발된 rat이 통증으로 뒷다리에 체중을 싣지 않는 특성에 기반하는 검사이다17). 뒷다리 체중 부하 측정일은 薏苡仁湯을 경구 투여 시작 1주일과 2주일째 되는 날 진행하였다. Incapacitance tester를 이용하여 쥐가 자연스럽게 서 있을 때 양발 각각의 무게를 측정하였다. 쥐의 오른쪽 무릎에 MIA로 인한 골관절염이 유발시키면, 쥐는 MIA를 주입하지 않은 왼쪽 발에 의지하여 tester의 holder 안에 서 있게 된다. 이때 오른쪽, 왼쪽 각 발의 무게(g)를 측정하여 산출하였다. 실험 결과로 골관절염을 유발한 오른쪽 뒷다리의 체중 부하량과 왼쪽 뒷다리(정상)의 체중 부하량을 구한 뒤 체중 부하 비율을 평가하였다.

체중 부하 비율 (%)=오른쪽 뒷다리 무게 왼쪽 뒷다리 무게+오른쪽 뒷다리 무게 ×100

8) 간 기능 분석

약물이 간 기능에 미치는 효과를 확인하기 위해 간 기능 분석을 실시했다. Aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT)는 assay kit (Wako Pure Chemical Industries Ltd.)로 측정하였다.

9) 단백질 발현량 분석

관절조직 내 염증 관련 지표를 측정하기 위해 단백질 발현량을 분석하였다. 단백질 발현량 분석을 위한 관절조직의 세포질을 얻기 위해 1.5 M sucrose, 7.5 pH의 5 mM Tris-HCl, 2 mM MgCl2, 7.4 pH의 100 mM Tris-HCl, 15 mM CaCl2와 protease inhibitor, 0.1 M DTT를 추가한 buffer A를 넣은 뒤 tissue grinder로 분쇄하여 NP-40 (10%)을 넣어주었다. Ice 위에서 20분 동안 방치 후 원심 분리기를 통해 2분간 12,000 rpm으로 상층액(세포질 함유)을 분리하였다. 핵을 획득하기 위하여 NP-40 (10%)을 추가한 buffer A로 2회 잘 씻어내고 100 µL의 buffer C (10% glycerol, 1 mM DTT, 0.3 mM NaCl, 50 mM KCl, 0.1 mM PMSF, 0.1 mM EDTA, 50 mM hydroxyethyl piperazine ethane sulfonicacid)를 추가하여 다시 부유시킨 뒤 10분 간격으로 vortexing을 3회 실시하였다. 4 ℃에서 12,000 rpm으로 10분 간격으로 원심 분리기를 통해 상층액(핵 함유)을 얻은 후 -80 ℃에서 세포질과 핵을 냉동 보관하였다. 관절조직 세포질의 β-actin, NOX4, p22phox, p-p38, p-IκBα, iNOS, IL-6, IL-10, IL-4, TNF-α, p-38, IκBα, MMP-1, MMP-13, TIMP-1 및 핵의 Histone, NF-κBp65 각 단백질 발현량을 확인하기 위해서 8~15% sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel을 만든 뒤 10 µg의 단백질을 전기영동한 후 SDS-polyacrylamide gel에서 nitrocellulose membrane으로 이동시켰다. 전기영동된 membrane에 분석하고자하는 1차 항체를 처리한 후 4 ℃에서 overnight 하였으며, phosphate buffered saline with Tween 20 (PBS-T)으로 8분 간격으로 6회 세척하고, 1차 항체에 맞는 2차 항체(PBS-T로 1:5,000 희석)를 사용하여 상온에서 2시간 30분 반응시킨 뒤, PBS-T로 8분 간격으로 5회 세척하였다. 그리고 ECL solution (GE Healthcare)에 membrane을 노출시킨 다음, Sensi-Q2000 Chemidoc에 감광시킨 후 해당 단백질의 발현을 확인한 뒤, band의 정량을 위해 ATTO Densitograph Software 프로그램을 이용하였으며, 각각의 단백질 수준을 정상군의 단백질 수준으로 나눈 후 상대적 비로 나타내었다.

10) 병리조직 분석

부검 후 오른쪽 관절 부위를 절단한 뒤 10% 포르말린 용액에 넣어 관절을 탈회시켜 radiographic technique을 적용한 후 탈회 유무를 평가하여 파라핀 왁스에 관절을 넣어 고정시킨 다음 coronal section을 진행하였다. 그 다음 파라핀으로 고정된 조직을 7 µm로 자른 후, H&E와 Safranin-O 염색을 시행하였으며 현미경을 이용하여 관절 조직의 상태를 관찰하였다.

11) 통계처리

실험 수치는 in vitro에서 mean±standard error of mean, in vivo에서 mean±standard deviation으로 나타냈으며, SPSS program for windows version 25 (IBM Corp.)로 one-way analysis of variance (ANOVA) 검정을 실시하였으며, 정상군과 대조군, 대조군과 약물 투여군 사이에 유의성은 p<0.05일 경우 유의성이 있다고 판정하였다.

결과»»»

1. Total polyphenol과 total flavonoid

실험에 사용된 EIIT의 total polyphenol 및 total flavonoid를 분석한 결과, total polyphenol의 경우 23.70±0.20 mg/g으로 나타났으며, total flavonoid의 경우 9.41±0.06 mg/g으로 나타났다(Table II).

Total Polyphenol and Total Flavonoid Contents of Euiiin-tang

Sample name Total polyphenol (mg/g) Total flavonoid (mg/g)
EIIT 23.70±0.20 9.41±0.06

All values are expressed mean±standard error of mean of three replications.

EIIT: Euiiin-tang water extract.



2. DPPH free radical 소거능

실험에 사용된 EIIT의 항산화 활성을 확인하기 위해 DPPH free radical 소거능을 분석한 결과, DPPH free radical 소거능 IC50값은 58.61±0.37 µg/mL로 나타났다(Fig. 1).

Fig. 1. Scavenging activity of EIIT on DPPH free radical. All values are expressed mean±standard error of mean of three replications. AS: ascorbic acid, EIIT: Euiiin-tang water extract, DPPH: 2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl.

3. ABTS free radical 소거능

실험에 사용된 EIIT의 항산화 활성을 확인하기 위해 ABTS free radical 소거능을 분석한 결과, ABTS free radical 소거능을 IC50값으로 나타낼 때 109.77±1.75 µg/mL이다(Fig. 2).

Fig. 2. Scavenging activity of EIIT on ABTS free radical. All values are expressed mean±standard error of mean of three replications. AS: ascorbic acid, EIIT: Euiiin-tang water extract, ABTS: 2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid).

4. 체중 및 식이효율 변화

실험기간 동안의 체중 측정 변화는 정상군 58.6±5.12, 대조군 68.9±5.86 (p<0.001), INDO군 60.8±10.09 (p<0.05), EIIT100군 57.4±8.43 (p<0.01), EIIT200군 59.6±11.50 (p<0.05)로 나타났다. MIA 유발 후 14일 동안 모든 실험군에서 체중이 증가하였으며, 대조군 대비 모든 약물 투여군에서 체중 변화가 유의성 있게 나타났다(Table III).

Body Weight Change of the Experimental Groups

Group Initial (g) Final (g) Change (g)
Normal 299.3±11.56 357.9±10.77 58.6±5.12
Control 266.6±6.04*** 332.9±9.39*** 68.9±5.86***
INDO 263.3±15.37 314.9±22.99 60.8±10.09
EIIT100 270.9±12.08 328.3±19.19 57.4±8.43††
EIIT200 269.8±12.30 329.4±22.03 59.6±11.50

Values are presented as mean±standard deviation (n=7/group).

Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats.

***p<0.001 vs. Normal, p<0.05, ††p<0.01 vs. Control.



식이효율은 정상군 19.06±1.82, 대조군 22.54±0.67 (p<0.05), INDO군 21.53±3.65, EIIT100군 20.29±1.44, EIIT200군 20.57±2.12로 나타났으며, 대조군 대비 약물 투여군에서 유의성은 보이지 않았다(Table IV).

Body Weight Gain, Food Intakes, Food Efficiency Ratio

Group Body weight gain (g/day) Food intakes (g/day) Food efficiency ratio (%)
Normal 4.19±0.36 21.98±0.23 19.06±1.82
Control 4.92±0.29*** 21.19±0.81 22.54±0.67*
INDO 4.32±0.47 20.35±2.89 21.53±3.65
EIIT100 4.10±0.47†† 20.17±0.97 20.29±1.44
EIIT200 4.26±0.75 20.60±1.60 20.57±2.12

Values are presented as mean±standard deviation (n=7/group).

Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT10: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats.

***p<0.001, *p<0.05 vs. Normal, p<0.05, ††p<0.01 vs. Control.



5. 뒷다리 체중 부하의 변화

각 실험군의 상대적 뒷다리 체중 부하 변화를 분석한 결과, MIA 유발 1주 후에 정상군 49.75±1.66, 대조군 36.02±3.13 (p<0.001), INDO군 42.63±4.98 (p<0.01), EIIT100군 43.07±6.02 (p<0.01), EIIT200군 45.31±5.12 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 증가하였다. 또한 2주 후에는 정상군 50.46±1.20, 대조군 34.17±9.15 (p<0.001), INDO군 45.63± 0.90 (p<0.01), EIIT100군 44.72±4.20 (p<0.01), EIIT200군 46.08±1.73 (p<0.01)으로 나타났으며, 대조군 대비 두 농도의 약물 투여군에서는 뒷다리 체중 부하가 유의성 있게 증가하였다(Table V).

The Changes of Hind Paw Weight Distribution

Group 0 day 7 days 14 days
Normal 50.52±1.80 49.75±1.66 50.46±1.20
Control 32.81±7.61*** 36.02±3.13*** 34.17±9.15***
INDO 32.47±6.90 42.63±4.98†† 45.63±0.90††
EIIT100 32.82±8.34 43.07±6.02†† 44.72±4.20††
EIIT200 33.23±7.17 45.31±5.12††† 46.08±1.73††

Values are presented as mean±standard deviation (n=7/group).

Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats.

***p<0.001 vs. Normal, ††p<0.01, †††p<0.001 vs. Control.



6. 간 기능 지표 분석

간 기능 지표인 AST의 수치(IU/L)를 분석한 결과, 정상군 47.53±1.85, 대조군 53.65±1.43 (p<0.01), INDO군 46.27±1.49 (p<0.01), EIIT100군 45.72±2.24 (p<0.01), EIIT200군 42.86±2.35 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 감소하였다. 또한 ALT의 수치(IU/L)의 경우, 정상군 10.44±0.41, 대조군 16.14±0.41 (p<0.001), INDO군 13.42±0.86 (p<0.01), EIIT100군 10.72±0.62 (p<0.001), EIIT200군 9.49±0.52 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 감소함을 보여주었다(Fig. 3).

Fig. 3. Effect of Euiiin-tang water extract (EIIT) on aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) on monosodium iodoacetate (MIA). Results are mean±standard deviation (n=7/group). Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: MIA-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats. **p<0.01, ***p<0.001 vs. Normal and ††p<0.01, †††p<0.001 vs. Control.

7. 관절 조직 내 산화적 스트레스 관련 단백질에 미치는 영향

1) NOX4

관절 조직에서 western blot을 통한 NOX4의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.07, 대조군 1.41±0.12 (p<0.001), INDO군 1.12±0.13 (p<0.01), EIIT100군 1.14± 0.29 (p<0.01), EIIT200군 1.15±0.18 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

Effects of EIIT on Protein Expression Analysis by Western Blot

Classification Antibody Normal Control INDO EIIT100 EIIT200
Oxidative stress NOX4 1.00±0.07 1.41±0.12*** 1.12±0.13†† 1.14±0.29†† 1.15±0.18††
p22phox 1.00±0.18 1.62±0.39*** 1.03±0.26††† 1.13±0.27††† 1.07±0.19†††
Inflammation related p-p38 1.00±0.20 1.77±0.34*** 1.08±0.27††† 1.29±0.30†† 1.19±0.27††
p-NF-κBp65 1.00±0.28 1.75±0.50*** 0.95±0.21††† 0.96±0.32††† 0.88±0.26†††
p-IκBα 1.00±0.25 1.48±0.38** 1.07±0.19†† 0.89±0.28††† 0.86±0.13†††
Inflammation mediators iNOS 1.00±0.24 1.58±0.41*** 1.21±0.13†† 1.19±0.14†† 1.10±0.17††
Inflammatory cytokines TNF-α 1.00±0.18 1.52±0.41*** 0.98±0.06††† 0.84±0.10††† 0.92±0.15†††
IL-6 1.00±0.16 1.59±0.30** 1.08±0.19†† 1.17±0.44 1.15±0.24††
Anti-inflammatory cytokines IL-4 1.00±0.24 0.80±0.03 1.09±0.30 0.80±0.17 1.12±0.26
IL-10 1.00±0.08 0.76±0.14** 1.01±0.16†† 0.85±0.13 1.16±0.25†††
Collagen-related factors MMP-1 1.00±0.14 1.63±0.04*** 1.26±0.22†† 1.30±0.24†† 1.30±0.29††
MMP-13 1.00±0.19 1.40±0.18** 1.10±0.13 1.04±0.30†† 1.04±0.14††
TIMP-1 1.00±0.09 0.94±0.13 0.96±0.28 0.87±0.11 1.14±0.16

Protein expression levels were expressed as folds of Normal. Values are presented as mean±standard deviation (n=7/group).

Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats, NOX4: nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase 4, p-p38: phospho p38, p-NF-κBp65: phospho nuclear factor κBp65, p-IκBα: phosphorylated inhibitor of κBα, iNOS: inducible nitric oxide synthase, TNF: tumor necrosis factor, IL: interleukin, MMP: matrix metalloproteinase, TIMP-1: tissue inhibitor of metalloproteinases-1.

**p<0.01, ***p<0.001 vs. Normal and p<0.05, ††p<0.01, †††p<0.001 vs. Control.



2) p22phox

관절 조직에서 western blot을 통한 p22phox의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.18, 대조군 1.62±0.39 (p<0.001), INDO군 1.03±0.26 (p<0.001), EIIT100군 1.13± 0.27 (p<0.001), EIIT200군 1.07±0.19 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

8. 관절 조직 내 염증성 단백질에 미치는 영향

1) p-p38

관절 조직에서 western blot을 통한 p-p38의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.20, 대조군 1.77±0.34 (p<0.001), INDO군 1.08±0.27 (p<0.001), EIIT100군 1.29± 0.30 (p<0.01), EIIT200군 1.19±0.27 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

2) NF-κBp65

관절 조직에서 western blot을 통한 NF-κBp65의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.28, 대조군 1.75± 0.50 (p<0.001), INDO군 0.95±0.21 (p<0.001), EIIT100군 0.96±0.32 (p<0.001), EIIT200군 0.88±0.26 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

3) p-IκBα

관절 조직에서 western blot을 통한 p-IκBα의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.25, 대조군 1.48±0.38 (p<0.01), INDO군 1.07±0.19 (p<0.01), EIIT100군 0.89± 0.28 (p<0.001), EIIT200군 0.86±0.13 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

9. 염증성 매개인자에 미치는 영향

1) iNOS

관절 조직에서 western blot을 통한 iNOS의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.24, 대조군 1.58±0.41 (p<0.001), INDO군 1.21±0.13 (p<0.01), EIIT100군 1.19± 0.14 (p<0.01), EIIT200군 1.10±0.17 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

10. 염증성 cytokine 발현에 미치는 영향

1) TNF-α

관절 조직에서 western blot을 통한 TNF-α의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.18, 대조군 1.52±0.41 (p<0.001), INDO군 0.98±0.06 (p<0.001), EIIT100군 0.84± 0.10 (p<0.001), EIIT200군 0.92±0.15 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

2) IL-6

관절 조직에서 western blot을 통한 IL-6의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.16, 대조군 1.59±0.30 (p<0.01), INDO군 1.08±0.19 (p<0.01), EIIT100군 1.17± 0.44 (p<0.05), EIIT200군 1.15±0.24 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

11. 항염증성 cytokine 발현에 미치는 영향

1) IL-4

관절 조직에서 western blot을 통한 IL-4의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.24, 대조군 0.80±0.03, INDO군 1.09±0.30 (p<0.05), EIIT100군 0.80±0.17, EIIT200군 1.12±0.26 (p<0.05)로 나타났으며, 대조군에 비하여 INDO군과 EIIT200군에서 유의성 있게 많이 발현하였다(Table VI, Appendicies).

2) IL-10

관절 조직에서 western blot을 통한 IL-10의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.08, 대조군 0.76±0.14 (p<0.01), INDO군 1.01±0.16 (p<0.01), EIIT100군 0.85± 0.13, EIIT200군 1.16±0.25 (p<0.001)로 나타났으며, 대조군에 비하여 INDO군과 EIIT200군에서 유의성 있게 많이 발현하였다(Table VI, Appendicies).

12. 관절 조직 내 콜라겐 관련 인자 발현에 미치는 영향

1) MMP-1

관절 조직에서 western blot을 통한 MMP-1의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.14, 대조군 1.63±0.04 (p<0.001), INDO군 1.26±0.22 (p<0.01), EIIT100군 1.30± 0.24 (p<0.01), EIIT200군 1.30±0.29 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

2) MMP-13

관절 조직에서 western blot을 통한 MMP-13의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.19, 대조군 1.40±0.18 (p<0.01), INDO군 1.10±0.13 (p<0.05), EIIT100군 1.04± 0.30 (p<0.01), EIIT200군 1.04±0.14 (p<0.01)로 나타났으며, 대조군 대비 INDO군, 약물 투여군에서는 유의성 있게 적게 발현하였다(Table VI, Appendicies).

3) TIMP-1

관절 조직에서 western blot을 통한 TIMP-1의 단백질 발현을 확인한 결과, 정상군 1.00±0.09, 대조군 0.94±0.13, INDO군 0.96±0.28, EIIT100군 0.87±0.11, EIIT200군 1.14± 0.16 (p<0.05)로 나타났으며, 대조군 대비 EIIT200군에서 유의성 있게 많이 발현하였다(Table VI, Appendicies).

13. 조직병리학적 변화에 미치는 영향

1) H&E 염색

손상된 연골의 회복 상태를 관찰하기 위한 H&E 염색 결과, 정상군은 연골 및 활막 조직 등이 변형이 일어나지 않은 정상적인 상태이지만 대조군의 경우, 골관절염이 유발되어 불규칙한 연골 표면과 활막 조직 및 연골의 변성과 변형이 현저하게 나타났다. INDO군, EIIT군의 연골 및 활막 조직 등은 대조군과 비교했을 시 정상 상태에 가까워 MIA 유발에 의한 손상이 효과적으로 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 4).

Fig. 4. Histological observation on joint (H&E, ×100). The knee joint was evaluated histologically to determine cartilage damage using H&E. The control group exhibited histological changes like irregular cartilage surface and cartilage degeneration. Besides, Euiiin-tang water extract (EIIT) treatment improved such histological features. Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats.

2) Safranin-O 염색

무릎 관절 조직의 proteoglycan 파괴 정도를 관찰하기 위해서 Safranin-O stain을 실시한 결과, 대조군의 경우, 골관절염이 유발되어 관절조직이 변형되고, 대부분의 proteoglycan이 파괴되어 연골의 형태학적 변화를 야기했다. 반면 INDO군, EIIT군의 경우, 대조군과 비교했을 시 proteoglycan의 소실과 관절 조직의 변형이 억제되는 것으로 관찰되었다. 또한 EIIT100군보다는 EIIT200군에서 proteoglycan의 소실이 억제되는 것으로 나타났다(Fig. 5).

Fig. 5. Histological observation on joint (Safranin-O staining, ×100). The knee joint was evaluated histologically to determine cartilage damage using Safranin-O staining. The control group showed severe proteoglycan loss. Besides, Euiiin-tang water extract (EIIT) treatment improved such histological feature. Normal: normal rats that did not induce osteoarthritis, Control: monosodium iodoacetate (MIA)-induced and distilled water administrated osteoarthritis rats, INDO: MIA-induced and indomethacin 5 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT100: MIA-induced and Euiiin-tang 100 mg/kg administrated osteoarthritis rats, EIIT200: MIA-induced and Euiiin-tang 200 mg/kg administrated osteoarthritis rats.
고찰»»»

골관절염에서는 연골의 파괴가 가장 특징적으로 나타나며 골극의 형성, 연골하 골경화, 활막의 염증과 같은 병리적 소견을 보인다. 연골은 연골세포의 변화와 사멸로 type 2 collagen, proteoglycan 등 세포 외 기질(extracellular matrix, ECM)의 생산이 감소되고, ECM 분해효소인 기질금속단백질분해효소(matrix metallopeptidases, MMPs)에 의해 ECM은 분해가 촉진되어 기본구조가 파괴되면서 관절의 부하를 견디지 못하게 된다. ECM 분해효소 중 MMP-13이 골관절염 발생에 특히 중요한 역할을 하고, 연골의 파괴 과정에서는 TNF-α와 같은 염증성 cytokine이 중요한 역할을 하기 때문에 ECM 분해효소나 염증성 cytokine을 억제하는 치료제가 개발되고 있다18).

본 연구에서는 골관절염을 유도하기 위한 약물로 MIA를 선택하였는데, MIA로 유발된 골관절염을 바탕으로 한 동물실험은 Kalbhen에 의해 처음으로 정립되었으며 관절연골의 손상과 통증, 기능장애 등 사람의 골관절염의 증상과 유사하게 만들 수 있다19). 다양한 퇴행정도를 가진 동물 모델을 주입농도에 따라 만들 수 있는데 질환이 진행되는 정도와 통증의 강도를 평가함에 있어 정확성이 있다고 알려져 있다20). 또한 薏苡仁湯과 효능을 비교평가하기 위해 양성대조군으로 사용된 indomethacin은 비스테로이드성 항염제(nonsteroidal anti-inflammatory drugs)의 한 종류로서 cyclooxygenase (COX) 효소를 억제하여 prostaglandin의 생성을 억제하는 기전을 통해 진통효과를 가지는 약물로 밝혀져 있다21).

본 연구에 사용된 薏苡仁湯은 薏苡仁, 麻黃, 當歸, 蒼朮, 桂枝, 白芍藥, 甘草, 生薑으로 구성된 처방이다. 이 중 薏苡仁은 利濕建脾, 利濕除痺, 淸熱排膿의 효능이 있으며22), TNF-α, IL-1β, IL-6 등 염증성 cytokine의 억제효과가 있음이 밝혀져 있다23). 麻黃은 發汗散寒, 宣肺平喘, 利水消腫의 효능이 있으며22) DPPH, ABTS radical 소거능 등 항산화효과가 있고 iNOS와 IL-1β의 유의성 있는 감소를 보여 소염작용이 있다24). 當歸는 補血活血, 行氣止痛 하며22) ABTS radical 소거능을 보여 항산화효과가 있다25). 蒼朮은 燥濕健脾, 祛風散寒, 明目의 효능이 있으며22) NO의 생성과 iNOS, COX-2의 단백질 발현을 억제하여 소염작용이 있음이 알려져 있다26). 桂枝는 散寒解表, 溫經通脈의 효능이 있으며22) prostaglandin E2 생성을 저해하고 iNOS 및 COX-2의 발현이 감소되어 소염작용이 있다27). 白芍藥은 柔肝止痛, 養血斂陰, 平抑肝陽의 효능이 있고22) NO, NOS-II를 억제하고28), 甘草는 淸熱解毒, 調和諸藥 등의 효능이 있고22) 항염증효과가 있음이 밝혀져 있다29).

이처럼 薏苡仁湯을 구성하는 각각의 약재가 항산화, 항염증에 효과가 있음이 실험적으로 확인되었으므로 이로 구성된 薏苡仁湯 역시 골관절염에 효과가 있을 것으로 생각되어 본 연구를 진행하였다.

산화적 스트레스는 골관절염의 발병에 기여하며 증상을 악화시키는 것으로 보고된다30). 산화적 스트레스를 억제하는 것은 염증을 억제하여 골관절염을 개선시키는 효과가 있어31) 동물실험을 실시하기 전에 시험관내 실험으로 항산화 효과를 평가하기 위하여 EIIT의 total polyphenol과 total flavonoid 함량을 측정하고 DPPH 및 ABTS free radical 소거능 IC50을 측정하였다. IC50은 생성된 radical의 50% 정도를 억제할 수 있는 농도를 말하는데 EIIT의 DPPH free radical 소거능은 58.61±0.37 µg/mL이고 ABTS free radical 소거능은 109.77±1.75 µg/mL로 항산화 효과가 있음을 보여주었다(Figs. 1, 2). 또한 EIIT의 total polyphenol의 함량은 23.70±0.20 mg/g이며 total flavonoid 함량은 9.41±0.06 mg/g이었다.

이후 골관절염 rat 모델에 대해 EIIT의 효과를 검증하기 위해 어떠한 처치도 하지 않은 정상군(normal), MIA로 골관절염 유발 후 증류수를 경구 투여한 대조군(control), MIA로 골관절염 유발 후 indomethacin 5 mg/kg을 경구 투여한 군(INDO), MIA로 골관절염 유발 후 EIIT 100 mg/kg을 경구 투여한 군(EIIT100), MIA로 골관절염 유발 후 EIIT 200 mg/kg을 경구 투여한 군(EIIT200) 등 총 5개의 군으로 실험군을 분리하였다. 이들을 대상으로 체중변화와 식이 효율을 분석하였는데, 체중은 모든 군에서 증가하였으며 식이 효율에서는 대조군에 비해 EIIT 투여군에서 유의성 있는 차이가 없었음을 확인하였다. 이는 EIIT 투여가 식이로 인한 체중 변화에 영향을 미치지 않았음을 의미한다(Tables III, IV).

골관절염이 유발된 rat는 통증으로 인하여 유발된 뒷다리에 체중을 싣지 않는 특징17)으로 MIA를 주사한 1주 후부터 골관절염이 유발된 뒷다리와 정상 뒷다리의 체중 부하에 차이가 발생한다. 본 실험에서는 MIA를 주사한 1주 후에는 뒷다리 체중 부하가 대조군 대비 INDO군, EIIT 투여군에서는 유의성 있게 증가하였다. 또한 2주 후에는 대조군에 비해 두 농도의 EIIT 투여군에서는 유의성 있게 증가하였다(Table V). 이로 보아 EIIT은 MIA로 골관절염이 유발된 rat의 뒷다리 통증 감소에 효과가 있다고 판단된다.

약물이 간 기능에 미치는 효과를 확인하기 위해 간 기능 지표인 AST와 ALT를 분석한 결과, 두 지표 모두 대조군 대비 INDO군, EIIT100군 및 EIIT200군에서 증가 양상을 보이지 않음으로써, 실험 약물이 간 기능을 악화시키지 않음을 알 수 있었다(Fig. 3).

약물 투여는 2주간 하였고 부검 후 관절조직을 채취하여 우선 관절조직 내 산화적 스트레스 관련 단백질인 NOX4와 p22phox를 분석하였는데, 이들은 세포막에 존재하는 NADPH oxidase의 subunit으로서 이 효소가 작용하였을 시 radical을 형성하므로 산화적 스트레스가 유발된다. 평상시에 세포질에 존재하던 p47phox는 세포가 자극을 받으면 인산화 되면서 세포막 단백질 p22phox와 결합하여 활성화되어 superoxide (O2)를 생성하고, NOX4는 세포막의 p22phox의 조절에 의해 활성화되고 이 과정에서 미토콘드리아의 전자전달계에 의해 과생산된 O2에 전자를 운반하여 H2O2로 전환시키므로 염증반응에 관여한다고 알려져 있다32-34). 두 인자 모두 대조군에서 정상군보다 유의성 있게 상승하였으나 EIIT 투여에 의해 대조군 대비 NOX4가 유의성 있게 적게 발현하였으며(Table VI), p22phox는 정상 수준까지 적게 발현하는 것을 확인하였다(Table VI). 따라서 EIIT에 의한 두 인자의 감소는 산화적 스트레스를 효과적으로 감소시켜 염증을 억제하여 골관절염을 개선시킬 수 있음을 보여준다.

EIIT이 염증을 완화시키는지 평가하기 위해 염증 관련 단백질 p38, IκBα와 NF-κB를 확인하였다. p38은 세포내 신호전달을 담당하는 mitogen-activated protein kinase의 한 종류로서 염증반응과 관련된 효소 중 하나이며 p38의 인산화는 NF-κB를 유도한다. NF-κB는 염증 매개물질 생성을 조절하는 전사인자로서 외부에서 자극이 없는 상태에서는 IκBα와 결합하여 세포질 내에서 비활성 상태로 존재하지만, 외부 자극으로 IκBα가 인산화되면 p65 단백질이 핵 안으로 들어와 전사를 하게 된다. 이 과정에서 NF-κB가 활성화되면 염증 매개인자인 iNOS를 유도하고, 염증성 cytokine인 TNF-α와 IL-6를 유도하게 된다35,36).

iNOS는 신체 전반에 걸쳐 다양한 기능을 하는 전달자인 산화 질소(NO)의 과잉 생산을 유도한다. iNOS에 의해 생산된 NO는 활성산소와 결합하여 세포독성이 강한 과산화 질소이온(ONOO)을 생성한다. ONOO는 산화 및 지질 과산화를 유도하며 짧은 시간 내에 급속한 조직 손상을 유발한다. 따라서 iNOS의 억제는 ONOO의 전구체인 NO의 생성을 억제하여 조직 손상을 방지하는 데 의의가 있다37,38).

TNF-α는 주로 활성화된 대식세포가 분비하며 급성기 반응을 유도하는 cytokine의 일종이다. 주요 역할은 면역 세포의 활성 및 기능을 조절하고, 발열을 유도하며 세포사멸과 염증반응을 매개하여 종양의 생성과 바이러스 복제를 억제하는 기능을 수행한다39). TNF-α가 과다 분비되면 IL-1β와 IL-6 등과 같은 하위 cytokine의 분비를 촉진하여 활액 내 염증을 증가시키고 관절연골을 파괴시켜 골관절염의 진행을 유도한다40). IL-6은 TNF-α와 IL-1β 등과 같은 cytokine에 의해 분비가 촉진되고 B 세포의 분화와 T 세포가 증식하는 데 중요한 역할을 한다. 또한, 파골세포의 자극과 조골세포의 억제라는 두 가지 방식으로 골 형성을 억제하고 골 흡수를 촉진한다41).

골관절염 대조군에서는 p-p38이 유의성 있게 많이 발현하였고 IκBα의 인산화 증가에 의해 NF-κB가 유의성 있는 발현의 증가를 보였으며, 이는 결과적으로 NF-κB 활성화에 의한 iNOS, TNF-α 및 IL-6의 유의성 있는 단백질 발현의 증가로 이어졌다. 반면 EIIT 투여는 세 인자 모두를 대조군 대비 유의성 있게 억제하는 것을 보여주었으므로 항염증 효과가 있다고 판단된다.

한편, IL-4는 Th1 cell의 활성을 억제하여 IL-1과 TNF-α의 생산을 감소시키고, IL-1 수용체 길항제의 발현을 증가시켜 염증반응을 감소시킨다. 또한 Th2 cell의 성장에 중요한 역할을 하는 cytokine으로서 Th2 중재에 의한 면역은 염증과 관절손상을 경감시킨다42).

IL-10은 T cell, B cell, natural killer cell 및 mast cell 등 여러 면역 세포의 증식과 분화를 조절하는 면역 조절 cytokine으로서 가장 중요한 기능은 Th1 cell을 억제하는 것이다. 또한 대식세포가 활성화됨에 따라 생성되는 활성산소 및 IL-1, IL-6, IL-8 및 TNF-α 등과 같은 염증성 cytokine의 생성을 억제하여 염증 반응을 억제한다43,44).

본 연구에서 MIA 투여에 의해 감소된 항염증성 cytokine인 IL-4와 IL-10은 EIIT200 투여에 의해 대조군 대비 유의성 있게 많이 발현하는 것을 보였다. 따라서 EIIT 투여는 염증성 매개인자와 cytokine은 억제하고, 항염증성 cytokine은 증가시켜 항염증 효과를 보이는 것으로 판단된다.

다음으로 관절조직 내 콜라겐 관련 인자의 발현을 분석하였다. MMPs는 아연, 칼슘과 유관한 촉매효소의 종류로서 세포 외 기질의 성분을 분해한다고 알려져 있다. 이 중 MMP-1, MMP-13의 발현은 IL-1과 TNF-α에 대한 반응으로 활성화되고, type II 콜라겐의 분해에 관여한다. 또한, MMP-1과 MMP-13은 골관절염의 진행에 중요한 역할을 하여 관절염 치료의 주요 표적이 된다45). TIMPs는 MMPs와 서로 길항작용으로 MMPs의 분비를 제어하여 조절하는 역할을 한다46). 콜라겐 단백질 분해 인자인 MMP-1과 MMP-13은 MIA 투여에 의해 많이 발현하였고, 이는 EIIT 투여에 의해 유의성 있게 억제되었다. 반면 콜라겐 분해를 억제하는 인자인 TIMP-1은 EIIT200 투여군에서만 대조군 대비 유의성 있는 많은 발현을 통해 콜라겐 파괴를 억제하였다.

마지막으로 관절조직의 병리조직학적 변화에 미치는 영향을 관찰하기 위해 H&E 염색과 Safranin-O 염색을 실시하였다. H&E 염색에서 Hematoxylin은 청색 또는 보라색으로 염색되는 염기성, 양이온성 물질로서 호염기성, 음이온성 물질에 결합하는데 핵과 proteoglycan 등을 염색시킨다. Eosin은 빨강 또는 분홍색으로 염색되는 산성, 음이온성 물질로서 호산성, 양이온성 물질에 결합하는데 세포질을 염색시킨다. Safranin-O 염색은 양이온성 염색소로서 음이온과 결합하여 연골에 분포하는 proteoglycan의 양에 비례하여 적색으로 염색시키는 방법으로 proteoglycan의 농도 변화를 대략적으로 추정할 수 있다47). H&E 염색에서는 EIIT 투여가 연골의 변성 및 변형을 현저히 저하시키는 것을 볼 수 있었고, Safranin-O 염색에서는 EIIT 투여가 기질의 주요 성분인 proteoglycan이 파괴되는 것을 억제하여 대조군 대비 많은 proteoglycan을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

이상의 결과를 종합하여 볼 때, MIA로 유발된 골관절염에서 EIIT 투여는 NF-κB 염증 경로를 억제하여 염증성 단백질 발현을 억제하여 골관절염 유도로 인한 연골조직의 손상을 개선시킨 것으로 판단된다.

그러나 본 실험 기간은 2주간으로 짧은 기간에 관절염을 유발시킨 모델을 대상으로 실험하였으므로 골관절염의 모델로서 미흡한 점이 다소 있다. 또한 이 결과를 인체에 적용하기 위해서는 관련된 추가 연구와 임상 연구가 진행되어야 할 것이다.

결론»»»

薏苡仁湯이 MIA로 유발된 골관절염 동물 모델에 미치는 영향을 확인한 결과 항산화, 항염증 작용이 있고 연골 손상을 회복시키는 효능이 있었다.

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April 2024, 34 (2)

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