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J Korean Med Rehabi 2024 Apr; 34(2): 1-14  https://doi.org/10.18325/jkmr.2024.34.2.1
Effects of Extracts from Cnidium officinale and Angelica sinensis on Bone Fusion in Mice with Femoral Fracture
Published online April 30, 2024
Copyright © 2024 The Society of Korean Medicine Rehabilitation.

Sang Woo Kim, K.M.D., Min-Seok Oh, K.M.D.

Department of Korean Medicine Rehabilitation, College of Korean Medicine, Daejeon University
Correspondence to: Min-Seok Oh, Department of Korean Medicine Rehabilitation, College of Korean Medicine, Daejeon University, 75, Daedeok-daero 176beon-gil, Seo-gu, Daejeon 35235, Korea
TEL (042) 470-9424
FAX (042) 470-9005
E-mail ohmin@dju.ac.kr
Received: March 21, 2024; Revised: April 1, 2024; Accepted: April 3, 2024
Abstract
Objectives The purpose of this study is to evaluate the fracture healing effect of extracts from Cnidium officinale and Angelica sinensis (CO/AS) in mice with femoral fracture.
Methods C57BL/6 mice were randomly divided into normal, control (phospate-bufferd saline), positive control (tramadol), CO/AS extract 40 ㎎/㎏ and 80 ㎎/㎏. By using Collier’s method, all groups except normal group went through femoral fracture. Aspartate aminotransferase (AST), alanine transferase (ALT), lactate dehydrogenase (LDH), blood urea nitrogen (BUN) and creatinine were measured to evaluate the safety of CO/AS. Hematoxylin & eosin, Safranin O staining, x-ray, tensile and compressive force were conducted to assess the effect of CO/AS on fracture.
Results The liver function test showed AST, ALT and LDH in CO/AS at 14th and 28th days were not significantly different compared with control group. The renal function test showed BUN in CO/AS at 14th days and BUN and creatinine in CO/AS at 28th days were significantly decreased compared with control group. The morphological & histological analysis and x-ray showed that CO/AS promoted cartilage and callus formation process compared with control group. The tensile and compressive forces test showed tensile in CO/AS 40 ㎎/㎏ and tensile & compressive forces in CO/AS 80 ㎎/㎏ were significantly increased compared with control group.
Conclusions CO/AS extract showed the possibility that it promotes early fracture union and increases bone tensile and compressive strength, while does not have hepatotoxicity. In conclusion, CO/AS has a potential to promote healing of bone fracture and this study warranted the clinical usage of CO/AS at bone fracture.
Keywords : Cnidium officinale, Angelica sinensis, Fracture healing, Femur fractured mice
서론»»»

골절은 뼈나 골단판 또는 관절면의 연속성이 완전 혹은 불완전하게 소실된 상태로 대부분 주변 연부조직의 손상과 동반하여 통증, 구조적 변형 등의 증상을 나타낸다1). 대부분 뼈에 강한 외력이 가해지는 외상 후에 발생하며, 노인 인구의 고령화, 스포츠 및 레저 활동 등의 증가로 인해 골절의 발생 빈도는 계속 증가하고 있다2,3).

골절의 치료는 골절의 정도, 부위, 합병증의 유무에 따라 고정술과 같은 수술적 치료나 도수정복, 고정술, 보조기 등의 비수술적 치료를 시행한다4). 약물치료는 골흡수억제제인 비스포스포네이트 제제와 골형성촉진제인 부갑상선호르몬이 있으나 대사되지 않고 체내에 축적되는 비스포스포네이트 제제의 특성과 부갑상선호르몬 투여 중단 후 단기간 내의 골밀도가 감소하는 단점으로 인해 추가적인 약물치료제 개발에 대한 필요성이 커지고 있다5,6).

한의학 서적 중《外臺秘要》에서는 “救急療救骨折, 接令如故”로 골절에 대한 병명을 처음 언급하였고7), ≪醫宗金鑑≫에서는 부위별 보호대를 활용하는 방법을 제시하였으며8), ≪聖濟總錄≫에서는 골절치료에 한약을 초기에는 活血祛瘀, 중기에는 接骨續筋, 후기에는 補氣養血, 健壯筋骨 하는 시기별 방법을 설명하였다9).

當歸(Angelica sinensis)와 川芎(Cnidium officinale)은 각각 補血和血과 活血行氣하여 골절 후 한방치료에 이용할 수 있는 약재로10), 골절 유합에 當歸와 川芎을 활용한 선행연구로 Yang 등11)은 當歸가 뼈세포 증식에 관여한다고 보고하였으며, Lee 등12)은 川芎이 파골세포 분화 및 골흡수 관련 유전자 발현과 연관하여 골대사에 영향을 미친다는 점을 보고하였다. 當歸와 川芎은 ≪東醫臨床方劑學≫에 골절 치료 경험방으로 소개된 加味芎歸湯의 주요 구성 약재로 쓰였을 뿐만 아니라13), 골절 유합에 효과적임을 보고한 복합약물연구 加味身痛逐瘀湯14,15), 順氣活血湯16), 復元活血湯17,18), 當歸鬚散19,20), 破血散疼湯21), 血府逐瘀湯22), 桃紅四物湯23)에서 當歸, 川芎은 함께 구성약물로 빈용되었으나 當歸와 川芎의 두 약재로 구성된 당귀천궁복합물의 골절에 대한 효과에 대한 연구는 없었다.

이제 저자는 당귀천궁복합물이 대퇴골절 동물모델의 골유합에 미치는 영향을 알아보고자 mouse의 대퇴골을 골절시킨 후 안전성 분석, 형태조직학적 분석 및 x-ray 분석과 인장력 압축력 분석을 하여 유의미한 결과를 얻었기에 보고하는 바이다.

재료 및 방법»»»

1. 재료

1) 약재

약재는 천궁(川芎, Cnidium officinale, CO)과 당귀(當歸, Angelica sinensis, AS)로 ㈜옴니허브(대구)에서 구입하여 각각 1:1의 비율로 천궁당귀복합물(CO/AS)을 구성하였고, 복합물 구성은 Table I과 같다.

The Herbal Compounds of CO/AS

Herbal name Scientific name Amount (g)
當歸 Angelica sinensis 6
川芎 Cnidium officinale 6
Total amount 12

CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis.



2) 동물

동물은 대한바이오링크(음성)에서 8주령 수컷 c57BL/6 mouse (22~25 g)를 분양받아 실험에 사용하였다. 실험동물은 실험 당일까지 물과 고형사료를 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 사육환경은 자유식이를 유지하면서 온도는 23±1 ℃로 맞추었고 12시간의 light-dark cycle 환경에 7일간 적응시킨 후 실험에 사용하였다. 본 연구의 동물 실험에 관한 모든 사항은 대전대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받은 후 진행하였다(승인번호: DJUARB2021-017).

2. 방법

1) 약재 추출

CO/AS를 추출하기 위해 한약재 100 g에 증류수 2 L의 증류수를 넣고 약탕기(Daewoong, Goesan)를 이용하여 약 2시간 동안 끓여 열수 추출하였다. 끓인 약재는 Whatman No. 2 filter (Maidstone, UK)로 여과하여 용액에 추출된 성분만 분리하였다. 여액은 rotary evaporator (Buchi, Switzerland)로 70 ℃에서 감압 증발한 뒤 동결건조하여 15.74 g의 건조분말을 얻어 추출효율은 15.74%였다. 분말은 -80 ℃에 분주하여 보관하였으며 사용하기 전 생리식염수로 희석하여 사용하였다.

2) 골절 동물 모델

골절은 Collier 등24)의 방법을 약간 수정하여 유발하였다. 실험동물을 호흡마취기(JD-C-107A; Jeungdo, Seoul)를 이용하여 아이프란액(isoflurane; Hana Pharm, Hwaseong)으로 마취시킨 후, 골절시킬 다리의 뒤쪽을 제모한 뒤 대퇴골의 바깥쪽 측면 피부조직을 수술용 가위를 이용하여 약 1 ㎝ 절개하였다. 이후 외측광근과 관절 주머니를 가위로 절개하여 무릎 쪽 대퇴골(distal femur)을 노출시킨 후 노출된 부위를 22 G 주사바늘로 찔러 대퇴골의 골수강에 일직선으로 위치시켰다. 바늘이 꽂혀있는 상태에서 대퇴골 골간에 수술용 가위를 이용하여 골절을 일으킨 후 근육과 피부를 7-0 나일론 봉합사(AILEE, Busan)를 이용하여 5 mm 간격으로 단순 결찰 봉합하였다. 반대쪽 다리도 같은 방법으로 골절을 유발하였다(Fig. 1).

Fig. 1. Photographs illustrating the surgical procedure for the femoral fracture model of mice.

3) 동물실험 설계

실험동물은 무작위로 5그룹으로 나누었다. 정상군, 대조군, 양성대조군은 각각 14마리씩, 실험군은 CO/AS 40 ㎎/㎏, CO/AS 80 ㎎/㎏ 각각 14마리씩 배속시키고 골절 후 14일, 28일째 되는 날 각 7마리씩 치사하였다(Fig. 2). 정상군은 대퇴골 골절 손상을 주지 않았다. 그 외 모든 군의 실험동물은 대퇴골에 골절 손상을 주었고 실험 약물은 골절을 유발한 당일부터 1일 1회, 일정 시간에 경구 투여하였다. 양성 대조군은 임상에서 수술 후 혹은 골절 후 진통제로 사용하는 tramadol 20 ㎎/㎏ (Sigma-Aldrich, MO, USA)을 사용하였다. 실험군(CO/AS)은 저농도(40 ㎎/㎏), 고농도(80 ㎎/㎏)의 용량으로 각각 경구 투여하였다.

Fig. 2. Experimental design of this study. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis.

4) Plasma 분리

마취된 실험동물의 심장에서 직접 채혈을 한 뒤 EDTA가 들어 있는 BD vacutainer tube (BD, USA)에 넣고 가볍게 흔들어 혈액 응고를 억제하였다. 이후 10분간 3,000 rpm에서 원심분리한 뒤 상등액을 취하여 plasma를 확보하였다.

5) 혈액생화학적 분석

실험동물로부터 분리한 혈장을 사용하여 혈액생화학적 분석을 자동생화학분석기(COBAS 8000 C702 analyzer; Roche Diagnostic system, Switzerland)를 사용하여 측정하였다. 혈액생화학적 분석을 위한 시약은 Roche Diagnostics (Indiana, USA)의 시약을 구매하여 사용하였다. Aspartate aminotransferase (AST), alanine transaminase (ALT)는 colorimetry 검사법을 이용하였고, lactate dehydrogenase (LDH)는 International Federation of Clinical Chemistry 검사법을 이용하였다. Blood urea nitrogen (BUN)은 kinetic test, creatinine는 enzyme법을 이용하였다.

6) 골절 부위의 형태학적 분석

치사된 실험동물로부터 골절된 대퇴골을 분리한 후, 골절이 치유된 정도를 파악하기 위해 대퇴골 주변의 근육을 최대한 제거하여 육안으로 형태학적 변화를 관찰하였다. 각 군에서 대표성을 보이는 2마리의 양쪽 대퇴골을 선택하여 사진 촬영하였다.

7) 골절 부위의 조직학적 분석

(1) 조직슬라이드 제작

치사된 실험동물로부터 골절을 유발한 다리의 무릎과 고관절을 절단하여 대퇴골을 포함하는 다리 부위를 적출하고 이후 대퇴골 주변의 근육을 최대한 제거한 후, 10% formalin에 1주일 동안 보관하여 조직을 고정하였다. 고정된 조직을 조직 처리하고 파라핀에 포매한 후 파라핀 블록을 4 ㎛ 두께로 박절하여 대퇴골 절편을 만들었다.

(2) Hematoxylin & eosin staining

탈 파라핀 후 함수, 수세 과정을 거쳐 Harris hematoxylin 과정을 10분간 처리하고, 수세 후 eosin Y에 1분 40초간 처리하였다. 그 다음 함수, 청명과정을 거쳐 cover glass를 덮고 봉입하였다. 조직슬라이드는 400배의 배율로 bright field microscope (Nikon, Japan)로 관찰하였다.

(3) Safranin O staining

탈 파라핀 후 슬라이드 조직에 Weigert’s iron hematoxylin 시약을 5분간 처리하였다. 수세 후 0.02% fast green 5분, 1% acetic aced 10초, 0.1% Safranin O 5분의 처리과정을 순서대로 거쳤다. 이후 함수, 청명과정을 거쳐 cover glass를 덮고 봉입하였다. 조직슬라이드는 400배의 배율로 bright field microscope (Nikon)로 관찰하였다.

8) X-ray 촬영

골절된 뼈와 재생된 뼈를 확인하기 위하여 x-ray (ROTANODE-E7239X; Toshiba, Japan)를 사용하여 대퇴골을 촬영하였다. X-ray 소스는 관전류 5 ㎃, 관전압 36 ㎸p로 촬영하였다. X-ray 촬영 후 Fire-CR (3DIHC, USA)을 사용하여 영상을 분석하였다.

9) 인장력 및 압축력 분석

치사된 실험동물로부터 골절을 유발한 다리의 무릎과 고관절을 수술용가위로 절단하여 대퇴골을 포함하는 다리 부위를 적출하였다. 이후 대퇴골 주변의 근육을 제거하고 생리식염수에 넣어 보관하였다. 보관된 대퇴골을 mold (R&B, Daejeon)를 이용하여 대퇴골의 양쪽 끝에 acrylic powder (R&B)와 acrylic liquid-hardner (R&B)를 2:1의 비율로 섞어 2시간 동안 굳혀 zig를 제작하였다. Zig를 붙인 대퇴골을 universial testing machine 시험기(LRX Plus; AMETEK LLOYD instruments, MA, USA)를 사용하여 인장력 및 압축력을 측정하였다. 분석은 NEXYGEN MT Software (version 4.5.1 lssue 3; Lloyd Instruments, UK)를 사용하여 분석하였다.

3. 통계분석

모든 실험 결과는 mean±standard deviation으로 기록되었으며, 통계처리는 GraphPad Prism 5 프로그램을 이용하였고, Mann-Whitney U test로 유의성을 검증하였다. p값이 0.05 미만일 때 통계적으로 유의성이 있다고 판정하였다.

결과»»»

1. 안전성 분석

1) 간기능 검사

(1) ALT

골절 유발 14일 후, ALT값은 CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군에서 19.54±2.68 u/ℓ으로 정상군에서 32.28±8.04 u/ℓ 및 대조군에서 27.73±1.65 u/ℓ으로 정상군과 대조군에 비해 유의하게 감소하였으나, CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군에서 22.52±5.22 u/ℓ으로 정상군과 대조군에 비해 감소하였지만 유의한 차이가 없었다(Fig. 3).

Fig. 3. Effects of CO/AS extract on the level of ALT in plasma. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, ALT: alanine transferase, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture. *p<0.01 vs normal, p<0.01 vs control.

골절 유발 28일 후, ALT값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 30.85±12.39, 23.00±2.58 u/ℓ이며 정상군에서 27.04±1.84 u/ℓ 및 대조군에서 28.20±11.42 u/ℓ으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 3).

(2) AST

골절 유발 14일 후, AST값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 79.74±24.90, 139.94±81.95 u/ℓ이며 정상군에서 122.50±71.83 u/ℓ 및 대조군에서 87.50±19.00 u/ℓ으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 4).

Fig. 4. Effects of CO/AS extract on the level of AST in plasma. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, AST: aspartate aminotransferas, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

골절 유발 28일 후, AST값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 188.50±175.813, 98.25±59.48 u/ℓ이며 정상군에서 111.18±59.44 u/ℓ 및 대조군에서 83.80±12.93 u/ℓ으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 4).

(3) LDH

골절 유발 14일 후, LDH값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 502.00±246.21, 606.25±446.52 u/ℓ이며 정상군에서 895.00±639.40 u/ℓ 및 대조군에서 551.00± 188.03 u/ℓ으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 5).

Fig. 5. Effects of CO/AS extract on the level of LDH in plasma. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, LDH: lactate dehydrogenase, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

골절 유발 28일 후, LDH값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 414.25±156.73, 463.40±268.61 u/ℓ이며 정상군에서 501.50±270.10 및 대조군에서 382.50±50.51 u/ℓ으로 유의한 차이가 없었다(Fig. 5).

2) 신기능 검사

(1) BUN

골절 유발 14일 후, BUN값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 20.76±4.05, 16.60±2.10 ㎎/㎗이며 정상군에서 22.32±1.08 ㎎/㎗ 및 대조군에서 23.42±4.98 ㎎/㎗으로 정상군과 대조군에 비해 감소하였으나 통계적 유의성은 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군에서만 있었다(Fig. 6).

Fig. 6. Effects of CO/AS extract on the level of BUN in plasma. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, BUN: blood urea nitrogen, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture. *p<0.01 vs normal, p<0.05, p<0.01 vs control.

골절 유발 28일 후, BUN값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 19.33±2.57, 17.75±0.83 ㎎/㎗이며 정상군에서 26.32±2.28 ㎎/㎗ 및 대조군에서 22.16±1.04 ㎎/㎗으로 정상군과 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 6).

(2) Creatinine

골절 유발 14일 후, creatinine값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 0.316±0.032, 0.418±0.070 ㎎/㎗이며 정상군에서 0.248±0.071 ㎎/㎗ 및 대조군에서 0.298± 0.054 ㎎/㎗으로 정상군과 대조군보다 증가하였으나 통계적 유의성은 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군에서만 있었다(Fig. 7).

Fig. 7. Effects of CO/AS extract on the level of creatinine in plasma. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture. *p<0.05, p<0.01 vs normal, p<0.05, §p<0.01 vs control.

골절 유발 28일 후, creatinine값은 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 각각 0.223±0.021, 0.240±0.028 ㎎/㎗이며 정상군에서 0.286±0.040 ㎎/㎗ 및 대조군에서 0.282± 0.024 ㎎/㎗으로 대조군에 비해 유의하게 감소하였다(Fig. 7).

2. 골절 부위의 형태학적 분석

대퇴골 골절을 유발한 뒤 14일과 28일 후 육안으로 골절의 부상 부위와 callus의 형성과 크기를 관찰하였다. 골절 유발 14일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 대퇴골의 골절 부위에 callus가 형성된 것을 확인할 수 있었다. 육안으로 관찰한 callus의 크기가 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 대조군에 비해 작아 보였다. 골절 유발 28일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 골절부위의 감소된 callus을 확인할 수 있었으며, CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군과 대조군의 차이는 크게 관찰되지 않았다(Fig. 8).

Fig. 8. Gross examination of bone morphology. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. The damaged femur was isolated by removing the muscles around the bone and investigated the morphology by gross examination. Yellow circle indicates the damaged bone region. Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

3. 골절 부위의 조직학적 분석

1) Hematoxylin & eosin staining

골절 유발 14일 후, 정상군을 제외한 모든 군에서 callus가 형성된 것을 광학현미경 상에서 확인하였다. 골절 유발 28일 후에 정상군을 제외한 모든 군에서 골절 부위의 callus의 크기가 전체적으로 감소하였으며, CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 대조군에 비해 골절선 간격이 감소한 것이 관찰되었다(Fig. 9).

Fig. 9. The histological analysis of femoral fracture with hematoxylin & eosin staining (magnification ×400). C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. The damaged femur was isolated by removing the muscles around the bone and investigated the morphology by hematoxylin & eosin staining. Dashed lines indicate fracture section. Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

2) Safranin O staining

골절 유발 14일 후, 정상군을 제외한 모든 군에서 붉은색으로 나타나는 chondrocyte가 생성되었고 cartilage가 형성되면서 골절 조직의 유합을 위한 조직 형태의 변화가 나타나기 시작했다. 이때, CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 골절 영역 주변의 cartilage 영역이 대조군에 비해 확연하게 증가하여 형성된 것을 확인할 수 있었다. 골절 유발 28일 후에도 cartilage 영역이 대조군에서도 관찰되었으나 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 cartailge 영역이 현격히 감소되어 대조군에 비해 더 적게 관찰되었다(Fig. 10).

Fig. 10. The histological analysis of femoral fracture with Safranin O staining (magnification ×400). C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. The damaged femur was isolated by removing the muscles around the bone and investigated the morphology by Safranin O staining. Black head arrowheads indicate chondrocytes. Dashed lines indicate fracture section. Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

4. 골절 부위의 x-ray 분석

대퇴골 골절 유발 14일 후, x-ray 관찰 결과상 정상군을 제외한 모든 군에서 골절 부위를 중심으로 callus가 생성되고 28일 후에서 callus가 감소한 것을 확인할 수 있었다. 또한 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군 골절부위의 callus가 대조군에 비해 크게 형성되어있는 것을 확인할 수 있었고, 28일 후에는 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군 골절부위의 callus가 대조군에 비해 현저히 감소하는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 11).

Fig. 11. X-ray examination of bone morphology. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 14 and 28 days. The damaged femur was isolated by removing the muscles around the bone and investigated the bone morphology by x-ray. Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture.

5. 인장력 및 압축력 분석

1) 인장력

골절 유발 28일 후, 인장력 값은 정상군에서 47.76± 4.91 N이었을 때, 대조군은 13.38±2.81 N으로 정상군에 비해 유의하게 감소하였다. CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군은 각각 34.82±9.83, 38.43±5.88 N으로 유합된 대퇴골의 인장력이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 12).

Fig. 12. Effect of CO/AS extract on tensile of bone union after femoral fracture. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture. *p<0.01 vs normal, p<0.05, p<0.01 vs control.

2) 압축력

골절 유발 28일 후, 압축력 값은 정상군에서 56.73± 20.23 N이었을 때, 대조군은 31.24±8.86 N으로 정상군에 비해 감소하였으나 유의한 차이는 없었다. CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군은 51.05±21.39 N으로 대조군에 비해 증가하였으나 유의한 차이는 없었다. CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군은 74.60±9.96 N으로 유합된 대퇴골의 인장력이 대조군에 비해 유의하게 증가하였다(Fig. 13).

Fig. 13. Effect of CO/AS extract on compressive force of bone union after femoral fracture. C57/BL6 mice with femoral fracture were treated with 40 and 80 ㎎/㎏/day of CO/AS extract for 28 days. CO/AS: Cnidium officinale and Angelica sinensis (40 and 80 ㎎/㎏/day) extract treated group after femoral fracture, Normal: mice without femoral fracture, Control: phosphate-buffered saline treated group after femoral fracture, Tramadol: tramadol (20 ㎎/㎏/day) treated group after femoral fracture. *p<0.01 vs control.
고찰»»»

골절이란 뼈 또는 골단판의 연속성이 소실된 상태로 노인 인구가 2000년에 전체 인구 중 7.2%에서 2020년에 이르러 15.7%로 2배 이상 증가함에 따라, 최근 5년간 골절 환자 수도 60대 이상을 중심으로 연평균 0.5% 이상 증가하였다25,26). 고령환자의 골절은 내과적 기저 질환을 갖고 있는 경우가 많아 골절 후 사망률 또한 높다27). 골절의 치료 목표는 합병증을 최소화하고 골절유합 후 재활치료를 통한 삶의 질과 일상생활로의 빠른 회복이다28). 이에 따라 골절유합을 촉진함으로써 치유기간을 단축시킬 수 있는 수술치료과 약물에 대한 관심이 높아지고 있다29,30).

골절 치유의 과정은 염증기, 복원기, 재형성기를 가지며 이 중 복원기는 연성가골기와 경성가골기를 포함한다1). 연성가골기는 혈종이 감소하면서 연성 가골이 형성되는 시기로, 골절부의 혈류 순환을 개선하여 형성된 가골에 혈류와 모세혈관의 침투를 증가시키며, 경성가골기에는 신생골이 석회화가 되어 뼈가 단단해지며, 형성된 가골이 성숙해지고 파골세포에 의해 흡수되는 재형성기가 진행된다31).

골절에 대한 한의학적 개념은 ≪外臺秘要≫에서 처음으로 제시되었으며7), ≪辯證奇聞≫에서는 ‘內治之法 必須以活血化瘀爲先 血不活則瘀不能去 瘀不能去則骨不能接’이라 하여 골절 환자의 초기 치료에 活血化瘀의 중요성을 강조하였다32).

현재까지 골절 치료를 위한 다방면의 한약 연구가 보고되었다. 방제를 활용한 연구로는 加味芎歸湯33), 加味身痛逐瘀湯14,15), 順氣活血湯16), 復元活血湯17,18), 當歸鬚散19,20), 破血散疼湯21), 血府逐瘀湯22), 桃紅四物湯23) 등이 있으나 골절유합에 효과적임을 보고한 방제들의 주된 공통 구성 약물인 當歸와 川芎만을 활용한 당귀천궁복합물의 골절 유합 개선에 관한 연구는 없었다.

當歸는 미나리과(Apiaceae)에 속하며 Angelica sinensis의 뿌리를 건조시킨 것으로 한의학적으로는 모든 血病의 요약으로 補血和血, 散瘀消腫하여 외과질환에도 사용 될 수 있는 약재이다10). 當歸의 유효성분은 z-ligustilide, n-butylidenephthalide으로 adenosine diphosphate 혈소판 활성화인자 제한을 통해 혈전 생성을 억제하고, fibroblast 증식과 osteoprecursor cells-1의 osteogenesis를 촉진하여 촉진뼈와 혈관 및 기타 결합조직의 재생에 관여하는 것으로 보고되고 있다34-36). 또한 川芎은 미나리과(Apiaceae)에 속하며 Cnidium officinale Makino의 뿌리를 건조시킨 것으로 한의학적으로는 血中의 氣약으로 活血行氣의 효능이 있다10). 川芎의 유효성분은 tetramethylpyrazine와 ferulinolol으로 각각 receptor activator of nuclear factor kappa B ligand 및 interleukin-6를 조정하여 조골세포 분화를 촉진시키고, β1수용체를 선택적으로 차단하여 혈액순환을 촉진시킨다는 보고가 있다37,38). 따라서 當歸의 補血和血작용과 川芎의 活血行氣 하는 작용이 골절 부위의 혈류순환을 개선하며, 뼈 및 기타 결합조직의 재생을 활성화하여 골절 유합을 촉진시킬 수 있을 것이라는 가설을 세우고, 이를 평가하고자 하였다.

당귀천궁복합물(CO/AS)이 골절 유합에 미치는 영향을 평가하기 위해 실험동물을 무작위로 정상군, 대조군, 양성대조군에 14마리씩, 약물 투여군을 CO/AS 40 ㎎/㎏, CO/AS 80 ㎎/㎏으로 나눈 후 14마리씩 배속시키고 골절 후 14일과 28일에 7마리씩 치사하였다. 또한 C57BL/6 mouse model에서의 골절 치유의 과정은 21일경에 가골의 크기가 최대치에 이르고 이후 점차 크기가 줄어들어 골조직으로 대체되는 재형성기가 진행된다는 Isaksson 등39)의 연구에 따라, 14일은 경성 가골 형성기, 28일은 재형성기로 판단하여 골절 발생 후 14일과 28일을 기준으로 삼아 연구를 진행하였다.

당귀천궁복합물(CO/AS)의 안전성 평가를 위해 골절 유발 14일, 28일 후에 혈액검사를 통해 ALT, AST, LDH, BUN, creatinine 수치를 관찰하였다.

간기능 검사 중 AST, ALT 검사를 기본적으로 사용하며 간세포 손상 시 AST, ALT가 혈액에서 발견이 되는 효소이기 때문에 AST, ALT의 증가는 간 손상을 의미한다40). 골절 유발 14일 후 CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군의 ALT 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였으나 골절 유발 28일 후 대조군과 유의한 차이는 없었다. 골절 유발 14일 후, 28일 후 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군의 ALT 수치는 대조군과 유의한 차이는 없었다. 골절 유발 14일 후 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏의 AST 수치는 대조군과 유의한 차이는 없었다.

LDH는 체내의 모든 조직에 분포하고 있으며, 특히 간, 심장, 근육에 많이 분포되어 있는 효소로서 세포 손상 시 발견이 되는 효소이다. 또한 간질환, 혈액질환 등에서 고활성을 보이는 경우가 많아 급성간염과 같은 질환을 스크리닝하는데 유용한 검사이다41). 골절 유발 14일 후, 28일 후 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군의 LDH 수치는 대조군과 유의한 차이는 없었다. 이를 통해 CO/AS가 간에 독성을 유발하지 않음을 알 수 있었다.

일반적으로 흔히 사용되는 신기능 검사는 BUN과 creatinine이며 신기능 저하 시 수치가 증가하는 추세를 보인다42). 골절 유발 14일 후 CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군의 BUN 수치는 대조군에 비해 감소했으나 유의한 차이는 없었으며, CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군의 BUN 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 골절 유발 28일 후 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군의 BUN 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 골절 유발 14일 후 CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군의 creatinine 수치는 대조군과 유의한 차이는 없었다. 골절 유발 14일 후 CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군의 creatinine 수치는 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나 골절 유발 28 일 후 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군의 creatinine 수치는 대조군에 비해 유의하게 감소하였다.

CO/AS를 투여했을 때 골절 유발 14일 후 BUN 수치는 모두 대조군에 비해 감소하였으며, creatinine 수치는 증가하였다. 골절 유발 28일 후 BUN과 creatinine 수치는 모두 대조군에 비해 유의하게 감소하였다. 따라서 14일 후 creatinine 수치 상승이 CO/AS에 의한 것인지 정확하게 파악하기 어려우므로 향후 이에 대한 연구가 필요할 것으로 생각된다.

형태학적 분석은 각 군에서 가장 대표성을 띠는 골절 조직을 채택하여 촬영하였다. 그 결과 골절 유발 14일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 골 유합이 진행되어 골절 부위에 callus가 관찰되었으며, CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 callus의 크기가 대조군에 비해 작음을 확인할 수 있었다. 골절 유발 28일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 callus의 크기가 감소하였으며, 각 군의 크기 차이는 확인되지 않았다. 이는 mouse의 골절 모델에서 21 일에 callus의 크기가 가장 커진 뒤 감소하는 것으로 알려져 있으므로39), 이는 CO/AS가 가골의 형성과 흡수를 촉진한 것으로 생각된다.

골절된 대퇴골에 hematoxylin & eosin 과 Safarin O 염색을 이용하여 조직학적 분석을 하였다. 그 결과 hematoxylin & eosin로 염색했을 때, 골절 유발 14일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 골 유합이 진행되어 골절부위에 callus가 관찰되었고, 골절 유발 28일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 감소된 callus를 확인할 수 있었다. 또한 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 대조군에 비해 골절선 간격이 감소한 것을 관찰하였다. Safranin O로 염색했을 때, 정상군을 제외한 모든 군에서 골 유합이 진행되어 골절 영역 주변에 cartilage가 관찰되었으며 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 골절 영역 주변의 cartilage 영역이 대조군에 비해 확연하게 증가하여 형성된 것을 확인할 수 있었다. 골절 유발 28일째에는 정상군을 제외한 모든 군에서 cartilage가 감소했으나 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군에서 cartailge 영역이 대조군에 비해 현격히 감소한 것이 관찰되었다. 이를 통해 조직학적 관찰 결과 CO/AS가 연성가골기와 재형성기를 대조군보다 빠르게 앞당겨 초기 골절 유합을 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.

X-ray 분석을 통해 골절 유발 14일 후 정상군을 제외한 모든 군에서 골절 부위를 중심으로 callus가 생성된 것을 확인할 수 있었으며, CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군 골절부위의 callus가 대조군에 비해 크게 형성되어있는 것을 확인할 수 있었다. X-ray 상 골절 유발 28일에서는 정상군을 제외한 모든 군에서 callus가 감소한 것을 확인할 수 있었으나, CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군 골절부위의 callus가 대조군에 비해 더 감소된 것을 확인할 수 있었다. 이를 고려하였을 때 고농도의 CO/AS가 골절 유합 과정에서 callus의 형성을 촉진시키며 골 유합을 빠르게 진행시키는 것을 알 수 있었다.

일반적으로 기계물리적 분석 중 인장력과 압축력은 뼈의 유연성과 강도를 의미한다. 단백질과 같은 콜라겐 성분이 많을수록 뼈의 인장력이 증가하며, 칼슘과 같은 미네랄 성분이 뼈에 많을수록 압축력이 증가하는 것으로 보고되고 있다43). 골절 유발 28일 후 CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군의 인장력은 대조군에 비해 유의하게 증가하였으나, CO/AS 40, 80 ㎎/㎏ 실험군의 인장력은 정상군에 비해 약했다. 이는 골절 28일 후에도 골절된 뼈의 유연성이 완전히 회복되지는 않았으며, CO/AS의 고용량 투여를 뼈의 인장력 증가를 위해 28일간 활용할 수 있음을 제시한다.

골절 유발 28일 후 CO/AS 40 ㎎/㎏ 실험군의 압축력은 대조군에 비해 증가하였으나 유의한 차이는 없었으며, CO/AS 80 ㎎/㎏ 실험군의 압축력은 대조군에 비해 유의하게 증가하였으며 정상군보다도 압축력이 유의하지는 않지만 증가하였음을 알 수 있었다. 이를 통해 CO/AS의 투여는 골절 후 골유합에 있어 미네랄 성분의 생성과 관련되며, 특히 CO/AS의 고용량 투여를 더 고려해볼 수 있음을 제시한다.

본 연구는 다음과 같은 제한점을 가지고 있다. 첫째, 골절 유발 후 7일인 염증기를 포함하여 연속적인 관찰이 가능한 실험 기간 설정을 하지 못했다. 골절 유발 후 14일과 28일인 복원기와 재형성기를 관찰하였으나 골유합 진행 촉진 시기를 정확하게 살펴보기 위해 염증기를 포함하는 보완된 연구를 이후에 진행해야 할 것이다. 둘째, mouse의 골절 치유과정을 설명한 Isaksson 등39)의 mouse는 20~25주령의 암컷으로 C57BL/6로 mouse는 같았으나 성별과 연령이 달라, 이후에 성별과 연령을 통일한 연구를 진행해야 할 것이다. 셋째, 골절유합 촉진 기전과 관련된 Runx2, Sox9 및 골형성 지표인 osteocalcin에 관하여 추후 CO/AS의 기전연구가 필요할 것으로 사료된다.

이상의 연구 결과를 종합해보자면 CO/AS를 투여했을 때, 안정성 검사 중 CO/AS가 간독성을 유발하지 않음을 알 수 있었으며, 골절부위의 육안 관찰에서는 유의한 차이가 없었으나 조직학적 분석 및 x-ray 상 CO/AS가 초기 골절 유합을 촉진시키며 연성가골기와 재형성기를 대조군보다 빠르게 앞당기는 가능성을 알 수 있었다. 또한 기계물리학적 분석을 통해 CO/AS가 골유합 과정상 신생골의 무기질화에 활발한 영향을 주어 뼈의 인장력과 압축력을 증가시키며 특히 CO/AS의 고용량 투여를 더 고려해 볼 수 있는 가능성을 제시했다.

결론»»»

당귀천궁복합물(CO/AS)이 골절 유합에 미치는 영향을 살펴보기 위하여 대퇴골 골절을 유발한 생쥐를 이용하여 안전성 분석, 형태학적 분석, 조직학적 분석, x-ray 검사, 인장력과 압축력 검사를 시행한 결과 다음과 같은 결론을 얻었다.

  • 간기능 검사 결과, 골절 유발 14일과 28일 후에 AST, ALT, LDH의 수치가 대조군과 비교하여 유의한 차이가 나지 않았다.

  • 신기능 검사 결과, 골절 유발 14일 후에 BUN의 수치와 28일 후에 BUN, creatinine의 수치는 대조군과 비교하여 유의하게 감소하였다.

  • 골절 부위의 형태조직학적 관찰 결과, 골절 유발 14일 후에 CO/AS에서 callus가 관찰되었고 cartilage의 형성이 대조군에 비해 증가하였으며, 28일 후에는 callus가 감소하였고 cartailge 영역과 골절선 간격이 대조군에 비해 감소하였다.

  • X-ray 분석 결과, 골절 유발 14일 후에 CO/AS에서 callus가 관찰되었고 28일 후에는 감소하였다. CO/AS 80 ㎎/㎏에서 callus의 형성이 대조군에 비해 빠르게 진행되었다.

  • 인장력과 압축력 분석 결과, 골절 유발 28일 후에 CO/AS 40 ㎎/㎏에서 인장력과 CO/AS 80 ㎎/㎏에서 인장력과 압축력은 대조군에 비해 유의하게 증가하였다.

이상과 같이 당귀천궁복합물(CO/AS)은 골 유합의 진행을 촉진하고, 골의 인장력과 압축력을 강화시키며, 임상적으로 골절 치료에 활용될 수 있을 것으로 생각된다.

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April 2024, 34 (2)

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